攜帶FLAG標(biāo)簽的人BTG2真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)

趙金匣，王志平，陶 燕，賀振華，郭 琦，洪 梅

（蘭州大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科研究所 甘肅省泌尿系疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室甘肅省泌尿系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)中心，甘肅 蘭州 730030）

BTG2Pc3／Tis21是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的抗增殖基因，屬于BTG／TOB基因家族，實(shí)驗(yàn)室和臨床研究［1］均表明BTG2可能是一個(gè)抑癌基因。BTG2在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞生長(zhǎng)與分化和DNA損傷修復(fù)等方面發(fā)揮著重要功能，該基因已被證實(shí)對(duì)多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有抑制作用［2－4］。最初 BTG2Pc3／Tis21基因是在大鼠Pc12嗜鉻細(xì)胞瘤株cDNA文庫(kù)中被發(fā)現(xiàn)的，Pc3是可被神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF）特異誘導(dǎo)的具有抗增殖活性的蛋白。隨后，F(xiàn)letcher等在小鼠NIH3T3細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了相似的序列并將其命名為Tis21，Tis21能被腫瘤促進(jìn)劑佛波酯（12－O－tetradecanoylphorbol－13－acetate，TPA）誘導(dǎo)，屬早期應(yīng)答基因［5］。人BTG2基因最早是由Rouault等在尋找p53的靶基因時(shí)發(fā)現(xiàn)并克隆成功的，人BTG2基因位于人類染色體1q32區(qū)，編碼一個(gè)含有158個(gè)氨基酸的蛋白，蛋白N端含有一個(gè)高度保守的APRO功能結(jié)構(gòu)域［6］。BTG2高表達(dá)于腎近端小管、肺泡支氣管上皮細(xì)胞和前列腺腺泡的基底細(xì)胞層［7］。研究［8］證明BTG2能被抑癌基因p53誘導(dǎo)而發(fā)生轉(zhuǎn)錄激活，并進(jìn)一步參與細(xì)胞周期調(diào)控和DNA損傷應(yīng)答。BTG2還能抑制細(xì)胞周期蛋白cyclin D1的轉(zhuǎn)錄，通過誘導(dǎo)G1期阻滯抑制細(xì)胞周期進(jìn)展。目前的研究提示：BTG2發(fā)揮抗腫瘤作用的分子機(jī)制，主要是通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控和mRNA降解途徑影響一系列腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，另外還可能通過蛋白質(zhì)相互結(jié)合發(fā)揮作用，然而其具體的作用機(jī)制并不十分清楚。BTG2是一個(gè)新近發(fā)現(xiàn)的蛋白，能夠從生物公司購(gòu)買到的抗體雖有不少種，但這些抗體的靈敏度和特異性都非常有限，應(yīng)用效果欠佳。在缺乏有效抗體的情況下，為開展蛋白質(zhì)功能研究，本課題組在BTG2的N端插入了一個(gè)FLAG標(biāo)簽。FLAG是由8個(gè)氨基酸（NAsp－Tyr－Lys－Asp－Asp－Asp－Asp－Lys－C）組 成 的 親水性短肽，可標(biāo)記于重組蛋白質(zhì)的N端、C端或中心。FLAG標(biāo)簽具有抗原性，能被抗FLAG抗體識(shí)別，因此帶FLAG標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白就可通過Western blotting法和免疫熒光技術(shù)等方法進(jìn)行方便的檢測(cè)。由于FLAG標(biāo)簽很小，通常對(duì)目標(biāo)蛋白的立體結(jié)構(gòu)和生物活性不會(huì)產(chǎn)生影響，可幫助分析靶蛋白的生物學(xué)功能［9］。本實(shí)驗(yàn)利用蛋白標(biāo)簽的優(yōu)點(diǎn)，在 pcDNA3.1（＋）－BTG2質(zhì)粒中插入了FLAG標(biāo)簽，將質(zhì)粒導(dǎo)入HeLa細(xì)胞系中，用標(biāo)簽抗體檢測(cè)到了目標(biāo)蛋白的表達(dá)，為進(jìn)一步研究BTG2蛋白的功能奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器 HeLa細(xì)胞復(fù)蘇自本研究所凍存細(xì)胞，培養(yǎng)基和血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。pcDNA3.1（＋）質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，pSG5－BTG2質(zhì)粒由意大利Perugia大學(xué)Francesco Grignani教授惠贈(zèng)。DH5α感受態(tài)細(xì)胞、DNA Marker、氨芐青霉素和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根公司，Prime STAR HS DNA聚合酶、T4DNA連接酶和限制性核酸內(nèi)切酶購(gòu)自寶生物公司，引物合成及DNA測(cè)序由上海生物工程有限公司完成。Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，蛋白Marker購(gòu)自美國(guó)NEB公司，單克隆 ANTI－FLAG M2抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。Odyssey封閉液和IRDye 800CW偶聯(lián)的羊抗鼠二抗購(gòu)自北京北方儀濤商貿(mào)有限公司。DNA電泳槽和電泳儀為北京六一儀器公司產(chǎn)品，PCR儀、Western blotting所使用的電泳槽和半干轉(zhuǎn)印槽為美國(guó)Bio－Rad公司產(chǎn)品，Odyssey近紅外激光掃描成像儀為美國(guó)Li－Cor公司產(chǎn)品。

1.2 pcDNA3.1（＋）－BTG2載體的構(gòu)建及鑒定由于pSG5載體表達(dá)效率比較低，而且沒有可供穩(wěn)定轉(zhuǎn)染使用的新霉素抗性基因，所以本研究以pSG5－BTG2質(zhì)粒為模板，用PCR方法擴(kuò)增出BTG2全長(zhǎng)編碼序列，重新插入pcDNA3.1（＋）載體的EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)之間。根據(jù)BTG2 mRNA序列（NM＿006763.2）的編碼區(qū)設(shè)計(jì)PCR引物，在上游引物中插入EcoRⅠ酶切位點(diǎn)（GAATTC）和 Kozak翻譯起始序列（GCCACC），在下游引物中插入XhoⅠ酶切位點(diǎn)（CTCGAG）。引物序列如下，BTG2－F：5′－ATAGAATTCGCCACCATGAGCCACGGGAAGGGAAC－3′，BTG2－R：5′－ATACTCGAGCTAGCTGGAGACTGCCATCACGTAG－3′。以pSG5－BTG2質(zhì)粒為模板，用高保真Prime STAR HS DNA聚合酶進(jìn)行PCR，PCR 反 應(yīng) 條 件 為：98℃、10s，55℃、15s，72℃、1min，30個(gè)循環(huán)。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證目的條帶后，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收BTG2目的片段。用EcoRⅠ和XhoⅠ分別雙酶切pcDNA3.1（＋）質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物，用T4DNA連接酶連接載體和插入片段。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，從LA培養(yǎng)板挑取6個(gè)單克隆，于100μL LA培養(yǎng)基中培養(yǎng)2h，取1μL菌液在25μL體系中進(jìn)行PCR鑒定，所用引物同上，選擇PCR陽(yáng)性的菌種送公司測(cè)序。

1.3 在pcDNA3.1（＋）－BTG2載體中插入 FLAG標(biāo)簽 設(shè)計(jì)Oligo DNA：根據(jù)FLAG的氨基酸序列設(shè)計(jì)2條互補(bǔ)的Oligo DNA，合成PAGE純化級(jí)DNA，2條鏈退火后插入pcDNA3.1（＋）－BTG2載體的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)之間。Oligo DNA序列如下，F(xiàn)LAG－top：5′－GATCGCCACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGG －3′，F(xiàn)LAG－bottom：5′－AATTCCTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCCATGGTGGC－3′。FLAG－top 包 含1個(gè)5′－BamHⅠ 酶 切 位 點(diǎn) 的 突 出 末 端 （5′－GATC）、Kozak翻譯起始序列（GCCACC）、起始密碼子（ATG）和 FLAG 編 碼 序 列 （GACTACAAGGACGACGATGACAAG），F(xiàn)LAG－bottom 包 含1個(gè)5′－EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的突出末端（5′－AATTC）。將 pcDNA3.1（＋ ）－BTG2 載 體 用 BamH Ⅰ 和EcoRⅠ雙酶切，退火后的Oligo DNA其突出的黏性末端可連接于酶切后的載體。Oligo DNA的退火和連接：將2條互補(bǔ)Oligo DNA進(jìn)行退火，先用TE溶解Oligo DNA至濃度為100μmol·L－1，然后將FLAG－top與FLAG－bottom溶液按1∶1混合（濃度為50μmol·L－1），退火條件為：95℃、30s，72℃、2min，37℃、2min，25℃、2min，冰上儲(chǔ)存。連接之前先用TE 1∶100稀釋退火Oligo至0.5μmol·L－1，連接反應(yīng)體系如下：酶切載體 （25mg·L－1）2μL，退火 Oligo DNA（0.5μmol·L－1） 1 μL， BSA （10g·L－1）0.5μL，10× T4DNA 連接酶緩沖液1.5μL，T4DNA連接酶（400U·μL－1）0.5μL，無(wú)核酸酶水9.5μL，室溫連接3h，但不要長(zhǎng)于3h，轉(zhuǎn)化前－20℃儲(chǔ)存。4μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化100μL感受態(tài)大腸桿菌DH5α后，在含氨芐青霉素的平板中篩選挑取菌落后抽提質(zhì)粒。構(gòu)建的載體用BamHⅠ酶切鑒定，酶切鑒定正確后進(jìn)行DNA序列測(cè)定。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 HeLa細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1d將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于60mm（20cm2）培養(yǎng)皿中，使其在次日細(xì)胞融合達(dá)到90%，用PBS洗細(xì)胞2次，換用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。利用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，將4μg質(zhì)粒DNA或10μL Lipofectamine 2000分別加入250μL無(wú)血清培養(yǎng)基中混勻，5min后將二者混勻，靜置20min后加入HeLa細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染過程用同等量的空載體質(zhì)粒作為對(duì)照，轉(zhuǎn)染6h后更換含10%血清的培養(yǎng)基。

1.5 Western blotting法檢測(cè) FLAG－BTG2蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染后48h收集細(xì)胞，用RIPA裂解液抽提細(xì)胞總蛋白，13000g、4℃ 離心30min，取5μL上清進(jìn)行蛋白定量。取40μg總蛋白經(jīng)10%SDS－PAGE凝膠分離，0.8mA·cm－2恒流30min轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用Odyssey封閉液封閉1h，一抗為 ANTI－FLAG（1∶1000 稀 釋）或ANTI－β－Actin（1∶500稀釋），一抗4℃孵育過夜。次日PBST洗膜3次，再與IRDye 800CW偶聯(lián)的羊抗鼠二抗（1∶5000稀釋）室溫孵育1h，然后PBST洗膜3次，采用Odyssey CLx紅外熒光掃描成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果以蛋白表達(dá)強(qiáng)度表示。

2 結(jié) 果

2.1 pcDNA3.1（＋）－BTG2載體的構(gòu)建與鑒定以pSG5－BTG2質(zhì)粒為模板，用PCR法擴(kuò)增出BTG2全長(zhǎng)編碼序列，重新插入表達(dá)效率高且能穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的pcDNA3.1（＋）載體。為證實(shí)載體中是否已插入目的基因，以轉(zhuǎn)化pcDNA3.1（＋）和BTG2連接產(chǎn)物的菌液為模板，進(jìn)行PCR鑒定（圖1）。圖1中P為陽(yáng)性對(duì)照（以pSG5－BTG2為模板進(jìn)行PCR），條帶1～6代表不同的菌落，可以看到在500bp處均有單一條帶，與理論值大小一致，說明各個(gè)載體均已插入BTG2片段。選取2個(gè)菌種進(jìn)行DNA測(cè)序，結(jié)果表明1號(hào)克隆的序列與設(shè)計(jì)完全一致，說明pcDNA3.1（＋）－BTG2載體構(gòu)建成功。

圖1 PCR法鑒定pcDNA3.1（＋）－BTG2質(zhì)粒電泳圖Fig.1 Electrophoregram of pcDNA3.1（＋）－BTG2vector identified by PCR method

2.2 pcDNA3.1（＋）－FLAG－BTG2載體的構(gòu)建及鑒定 為了表達(dá)FLAG－BTG2融合蛋白，本課題組在pcDNA3.1（＋）－BTG2載體中插入了一個(gè)FLAG標(biāo)簽 （圖2）。首先根據(jù)FLAG的氨基酸序列設(shè)計(jì)并合成2條互補(bǔ)的Oligo DNA，序列設(shè)計(jì)如圖3所示，退火后Oligo DNA突出的黏性末端即可直接連接于酶切后的載體。為便于陽(yáng)性克隆的鑒定，在設(shè)計(jì)Oligo DNA時(shí)，特別將BamHⅠ酶切位點(diǎn)最右端的一個(gè)堿基刪除 （圖3），這樣插入FLAG后載體中的BamHⅠ酶切位點(diǎn)即被破壞，故空載體能被BamHⅠ切開，而插入FLAG的載體無(wú)法被BamHⅠ切開 （圖3）。用BamHⅠ酶切所構(gòu)建的載體，1～6號(hào)質(zhì)粒均未切開，說明均已插入FLAG序列 （圖4）。酶切鑒定后，將1號(hào)和2號(hào)陽(yáng)性克隆送寶生物公司進(jìn)行DNA測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示：2號(hào)克隆的DNA序列正確 （圖5），說明pcDNA3.1 （＋）－FLAG－BTG2載體構(gòu)建成功。

圖2 pcDNA－3.1（＋）－FLAG－BTG2載體結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of pcDNA－3.1（＋）－FLAG－BTG2vector

圖3 FLAG Oligo DNA設(shè)計(jì)Fig.3 Oligo DNA design of FLAG

圖4 pcDNA3.1（＋）－FLAG－BTG2質(zhì)粒的 BamH Ⅰ酶切電泳圖Fig.4 Electrophoregram of pcDNA3.1（＋）－FLAG－BTG2 plasmid digested by BamHⅠ

2.3 Western blotting法檢測(cè) FLAG－BTG2融合蛋白的表達(dá) 帶FLAG標(biāo)簽的BTG2融合蛋白在HeLa細(xì)胞中能夠有效表達(dá) （第3泳道），而第1泳道 （轉(zhuǎn)染空載體）和第2泳道 （轉(zhuǎn)染無(wú)FLAG標(biāo)簽的BTG2表達(dá)質(zhì)粒）沒有相應(yīng)的條帶。融合蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量約為20000，與人BTG2蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量接近。Western blotting法檢測(cè)的結(jié)果表明：FLAG－BTG2融合蛋白在HeLa細(xì)胞中獲得了成功表達(dá)。見圖6。

3 討 論

圖5 pcDNA3.1（＋）－FLAG－BTG2載體DNA測(cè)序圖譜Fig.5 Sequencing of pcDNA3.1（＋）－FLAG－BTG2vector DNA

圖6 Western blotting法檢測(cè)FLAG－BTG2在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)Fig.6 Expression of FLAG－BTG2in HeLa cells detected by Western blotting method

BTG2是BTG／TOB抗增殖基因家族的成員，研究［10－12］發(fā)現(xiàn)：BTG2在肺癌、乳腺癌和胃癌等多種腫瘤中表達(dá)水平較相鄰的癌旁組織降低，而且過表達(dá)BTG2則能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生DNA損傷、細(xì)胞分化和停止增殖等情況時(shí)，BTG2的表達(dá)會(huì)升高。BTG2還包含核受體LXXLL序列，能夠抑制雄激素受體 （androgen receptor，AR）介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，明顯減緩前列腺癌細(xì) 胞 的 生 長(zhǎng) 速 度［13］。維 甲 酸 （retinoic acid，RA）通過維甲酸受體 （retinoic acid receptor，RAR）控制造血細(xì)胞的分化，BTG2過表達(dá)能夠增加RARα的轉(zhuǎn)錄活性以及RA對(duì)白細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用。BTG2還參與p53－p21通路誘導(dǎo)的細(xì)胞復(fù)制性衰老 （replicative senescence），干擾BTG2的表達(dá)能夠延長(zhǎng)成纖維細(xì)胞的壽命，這種作用是通過結(jié)合和拮抗細(xì)胞周期調(diào)控蛋白Pin－1完成的［14］。另外，在前列腺細(xì)胞中干擾BTG2的表達(dá)后，E－Cadherin陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞遷移能力升高，細(xì)胞出現(xiàn)上皮細(xì)胞－間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 （epithelial－mesenchymal transition， EMT） 的 特 征［15］。BTG2是生長(zhǎng)因子或DNA損傷等信號(hào)通路的下游效應(yīng)分子，其執(zhí)行著抑制細(xì)胞增殖和侵襲、促進(jìn)細(xì)胞分化和衰老的功能。目前的研究已經(jīng)證明：BTG2的失活與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展具有密切的關(guān)系，但是其發(fā)揮作用的分子機(jī)制并不十分清楚，因此研究BTG2的功能、揭示其靶基因和相互作用蛋白是亟待解決的問題，這將為腫瘤的診斷和治療提供新的策略。

蛋白標(biāo)簽 （tag）是指通過DNA重組技術(shù)實(shí)現(xiàn)標(biāo)簽多肽與目標(biāo)蛋白 （target protein）的融合表達(dá) （fusion protein），標(biāo)簽有助于對(duì)目的蛋白進(jìn)行方便的檢測(cè)或純化。常用的蛋白標(biāo)簽有FLAG、HA、c－Myc、六聚組氨酸 （6×His）、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶 （GST）和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白 （eGFP）等。抗FLAG M2抗體能夠用于在蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)中識(shí)別FLAG融合蛋白，或利用免疫沉淀（immunoprecipitation）技術(shù)捕獲FLAG融合蛋白，可用于研究蛋白質(zhì)相互的作用。為了給BTG2的功能研究建立實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，本課題組在已構(gòu)建好的BTG2表達(dá)載體中插入了FLAG標(biāo)簽，構(gòu)建了表達(dá)FLAG－BTG2融合蛋白的真核表達(dá)載體。除了本研究所采用的實(shí)驗(yàn)方案外，帶標(biāo)簽的表達(dá)載體也可以一次構(gòu)建成功，但是一次完成構(gòu)建通常需要合成很長(zhǎng)的引物，引物過長(zhǎng)則在合成DNA時(shí)容易出錯(cuò)，導(dǎo)致最后構(gòu)建完成的載體發(fā)生序列錯(cuò)誤。而且，本實(shí)驗(yàn)所使用的方法同樣適用于在空載體或其他目的基因的表達(dá)載體中插入各種短小標(biāo)簽 （如c－myc、HA和6×His等）。由于插入的FLAG標(biāo)簽序列非常短小，無(wú)法用常規(guī)的雙酶切方法進(jìn)行鑒定，所以在設(shè)計(jì)Oligo DNA時(shí)就將BamHⅠ酶切位點(diǎn)最右端的一個(gè)堿基刪除，這樣插入FLAG后的載體無(wú)法再被BamHⅠ切開，可以方便地挑出陽(yáng)性克隆。構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HaLa細(xì)胞后，用抗FLAG抗體能夠檢測(cè)到FLAG－BTG2融合蛋白的表達(dá)。圖6中除了FLAG－BTG2條帶外，在其下方隱約可見另一模糊條帶，本文作者認(rèn)為這是由非特異性反應(yīng)造成的，是因?yàn)樵谵D(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞中（第1泳道）也有該條帶，而細(xì)胞內(nèi)源性蛋白中并沒有FLAG表位。本研究利用標(biāo)簽插入技術(shù)成功構(gòu)建了pcDNA3.1 （＋）－FLAG－BTG2真核表達(dá)載體，在轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后能夠有效表達(dá)FLAGBTG2融合蛋白，為更深入地研究BTG2蛋白的功能提供了實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。

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