RNA干擾下調HE4基因表達對人卵巢癌SK-OV-3細胞增殖和侵襲的影響

房青，王在，游嘉，詹雪梅，楊愛蓮，魏繼紅，房昭

卵巢癌是婦科死亡率最高的惡性腫瘤，其發病隱匿，進展迅速，僅有不到 25% 的卵巢癌能在 I期病變局限于卵巢時診斷[1]，大多數患者診斷時腫瘤已經擴散或轉移，盡管進行了積極的手術和化療，卵巢癌患者 5年生存率仍不足 30%[2]。人附睪蛋白 4（human epididymis protein 4，HE4），又名 WFDC2（WAP type four disulphide core protein 2），是近年來發現的一個新基因[3]，它在正常卵巢組織中不表達，而在卵巢癌組織高表達[4-5]，在卵巢癌患者血清中濃度顯著增高[6]，提示 HE4 可能在卵巢癌的發生發展中起重要作用，HE4 有可能成為卵巢癌輔助診斷和治療的重要靶標，但是目前對HE4 功能的研究較少。本文利用 RNA 干擾（RNA interference，RNAi）技術，特異性抑制卵巢癌細胞系 SK-OV-3 中 HE4 基因表達，觀察 HE4 基因表達下調對卵巢癌細胞增殖和侵襲能力的影響，為卵巢癌侵襲轉移的防治提供新的研究線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 人卵巢漿液性囊腺癌細胞系SK-OV-3 購自中國科學院上海細胞生物研究所細胞庫。

1.1.2 siRNA 人 HE4 基因特異性小分子干擾RNA（HE4-siRNA）及非特異性序列 siRNA（陰性對照）購自美國 Santa Cruz 公司。HE4-siRNA 根據基因庫 GenBank 中人 HE4 mRNA 序列（NM_006103.3，GI:56699494）設計，為 3 個 20 ～25 nt siRNA 雙鏈的混合物，基因序列見表 1。陰性對照 siRNA（目錄號 sc-37007），為 20～25 nt非特異序列 siRNA。

表1 人 HE4 基因小分子干擾 RNA（HE4-siRNA）序列Table1 Sequences of small interfering RNA targeted human HE4 (HE4-siRNA)

1.1.3 試劑 胎牛血清購自美國 Hyclone 公司；McCoy’s 5A 培養基和胰蛋白酶購自美國 Gibco公司；脂質體轉染試劑 LipofectamineTM2000 和Opti-MEM 培養基為美國 Invitrogen 公司產品；細胞總 RNA 提取試劑盒 RNeasy Mini Kit 購自美國 Qiagen 公司；反轉錄試劑盒為美國 ABI 公司產品；SYBR Premix Ex Taq 購自日本 Takara 公司；羊抗人 HE4 蛋白多克隆抗體（sc-27570）、兔抗人 β-actin 多克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗羊/兔二抗 IgG 為美國 Santa Cruz 公司產品；增強化學發光試劑 ECL 購自美國 Pierce 公司；細胞計數試劑盒 CCK8 購自日本 Dojindo 公司；人工基底膜基質凝膠 Martrigel 和 Transwell小室（裝有碳酸聚酯微孔膜，孔徑 8 μm）購自德國 BD Biosciences 公司。

1.1.4 儀器 7700 型實時熒光定量 PCR 儀購自美國 ABI 公司；NanoDrop 2000 超微量分光光度計和 Heraeus Fresc 21 臺式高速冷凍離心機為美國 Thermo Scientific公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人卵巢癌細胞系 SK-OV-3 用含 10% 胎牛血清的 McCoy’s 5A 培養基，在 37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養，為上皮細胞型，貼壁生長。每 2～3 天 用 0.25% 胰酶和 0.02%EDTA 常規消化、1∶3～1∶6 傳代培養。

1.2.2 siRNA 脂質體法轉染 SK-OV-3 細胞 將對數生長期 SK-OV-3 細胞接種 6 孔板，5×105個細胞/孔，在 37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養24 h，細胞密度約 60% 匯合時應用 LipofectamineTM2000 脂質體轉染 siRNA。分組如下：①HE4-siRNA組：轉染 3 種人 HE4 序列特異性 siRNA 混合物；②陰性對照組：轉染非特異性 siRNA；③正常對照組：正常培養 SK-OV-3，未做轉染。具體步驟按說明書進行，即用 250 μl 的 Opti-MEM 培養液稀釋 siRNA，終濃度為 40 nmol/L；同時取 250 μl的 Opti-MEM 培養液和 5 μl LipofectamineTM2000輕柔混勻，室溫孵育 5 min；將以上兩種溶液輕柔混勻，室溫孵育 20 min。將配制的 siRNALipofectamineTM2000 轉染混合液加入到 6 孔細胞培養板中，輕搖混勻，培養 6～8 h 后更換含10% 胎牛血清的 McCoy’s 5A 培養基，培養 48 h后收集細胞。

1.2.3 實時熒光定量 PCR 反應（RT-qPCR）檢測HE4 mRNA 表達水平 siRNA 轉染 SK-OV-3 細胞 48 h 后，按 RNA 提取試劑盒說明書提取SK-OV-3 細胞總 RNA，使用分光光度計測定RNA 純度和濃度，取 1 μg 總 RNA 用反轉錄試劑盒合成 cDNA。采用 Primer 5.0 軟件設計引物，HE4 引物序列：上游：5' ATAGCACCATGCCTGCT TGT 3'，下游：5' GGGAGTGACACAGGACACCT 3'；內參照磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）引物序列：上游：5' CTGCACCACCAACTGCTTAG 3'，下游：5' GAGCTTCCCGTTCAGCTCAG 3'，均由上海英駿生物科技有限公司合成。使用實時熒光定量 PCR儀進行 PCR 反應。20 μl 反應體系中包括：SYBR Premix Ex Taq（2 ×）10 μl，上下游引物各 0.8 μl，ROX 參比染料（50 ×）0.4 μl，cDNA 模板 2 μl，無核酸酶水 6 μl。反應條件：95 ℃ 預變性 30 s，95 ℃ 變性 5 s、60 ℃ 退火延伸 30 s，40 個循環。每個樣品設 2 個平行管，以 GAPDH 為內參照，記錄各樣本的循環閾值（cycle threshold，Ct），應用 2-△△Ct分析目的基因的表達量。其中 △Ct =CtHE4– CtGAPDH，△△Ct = △CtHE4-siRNA組或陰性對照組–△Ct空白對照組。

1.2.4 Western blot 檢測 HE4 蛋白表達水平 siRNA 轉染 SK-OV-3 細胞 48 h 后，Hanks液沖洗細胞 2 次，收集細胞，離心，去上清，細胞沉淀中加入適量的含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液，冰浴裂解 20 min，4 ℃ 條件下，離心半徑8.7 cm，以 12000 r/min 離心 20 min，取上清用BCA 試劑盒（Bradforde 比色法）測定蛋白質濃度。行 10% SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，將凝膠上的蛋白質轉移至 PVDF 膜上。加入含 5% 脫脂奶粉的封閉液室溫封閉 2 h 后，分別與羊抗人 HE4一抗（1∶200）或 β-actin 一抗（1∶1000）4 ℃ 孵育過夜，用含 0.05% 吐溫 20 的 TBS 緩沖液充分洗膜后，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗羊/兔 IgG（1∶10000），室溫孵育 1 h，TBS 洗膜后采用增強化學發光顯色試劑室溫孵育 5 min，X光膠片曝光，拍照。

1.2.5 CCK8 檢測細胞增殖活性 卵巢癌SK-OV-3 細胞 siRNA 轉染 48 h 后，胰酶消化，制備細胞懸液，接種 96 孔板，3000 個/孔，37 ℃，5% CO2條件下培養不同時間，加入 10% CCK8試劑，繼續培養 2 h，酶標儀測定 450 nm 處吸光度值，每組設 5 個平行樣，繪制細胞生長曲線。

1.2.6 細胞侵襲性分析 將 Transwell 小室插入24 孔板內，Matrigel 用無血清的 4 ℃ McCoy’s 5A 培養基稀釋至 8 μg/ml，取 60 μl 稀釋膠加至 Transwell 上室，室溫下干燥后，用無血清培養基輕洗凝膠 2 次備用。卵巢癌 SK-OV-3 細胞經 siRNA 轉染 48 h 后，胰酶消化，制備濃度為 105/ml 細胞懸液，加入 Transwell 上室，每孔200 μl，培養液為含 0.1% BSA 的 McCoy’s 5A 培養液；Transwell 下室加入 600 μl 含 10% FBS 的McCoy’s 5A 培養液作為趨化因子，37 ℃，5% CO2培養箱中孵育 12 h。取出小室，用濕棉簽輕輕擦去上室未穿過濾膜的細胞和 Matrigel 膠，剝下濾膜，常規 HE 染色。正置顯微鏡（200 ×）觀察并拍照，每片膜隨機計數 6 個視野內的穿膜細胞數，計算平均值。每組設 3 個平行樣。以如下公式計算侵襲抑制率。

侵襲抑制率 =（正常對照組穿膜細胞數 –HE4-siRNA 組穿膜細胞數）/正常對照組穿膜細胞數×100%

1.3 統計學處理

應用 SPSS 13.0 統計軟件進行分析。計量資料數據以表示，組間均數比較采用 t 檢驗，以 P < 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE4-siRNA 可下調人卵巢癌細胞系 SK-OV-3的 HE4 表達水平

實時熒光定量 PCR 結果顯示，與未轉染的空白對照組相比，HE4-siRNA 轉染組SK-OV-3 細胞中 HE4 mRNA 水平明顯降低，僅為空白對照組的12.7%（P < 0.01），而轉染非特異序列 siRNA 的陰性對照組細胞中 HE4 mRNA 表達水平與空白對照組無顯著性差異（P > 0.05）。Western blot 檢測結果顯示，HE4 蛋白表達水平變化與 mRNA 表達的變化一致（圖 1），表明人卵巢癌細胞系 SK-OV-3的 HE4 表達被成功下調。

圖1 siRNA 轉染對卵巢癌 SK-OV-3 細胞中 HE4 表達的影響（A：實時定量檢測 HE4 mRNA 表達；B：Western blot檢測 HE4 蛋白表達）Figure1 Effect of siRNA transfection on HE4 expression in SK-OV-3 cells (A: The expression of HE4 mRNA detected by real-time quantitative PCR; B: The expression of HE4 protein detected by Western blot)

2.2 HE4-siRNA 下調人卵巢癌細胞系 SK-OV-3的 HE4 表達對細胞增殖的影響

采用 CCK8 試劑檢測各組 SK-OV-3 細胞增殖情況，繪制細胞生長曲線，結果顯示，與正常對照組相比，HE4-siRNA 轉染組 SK-OV-3 細胞增殖被抑制，僅約為正常對照組的 60%，而陰性對照組細胞增殖無顯著變化（圖 2）。

圖2 人卵巢癌 SK-OV-3 細胞生長曲線Figure2 Growth curve of human ovarian cancer cell SK-OV-3

圖3 Transwell 小室模型檢測 siRNA 對卵巢癌 SK-OV-3 細胞侵襲的影響（200 ×）（A：正常對照組；B：陰性對照組；C：HE4-siRNA 組）Figure3 Effect of siRNA transfection on invasive ability of SK-OV-3 detected by Transwell chamber method (200 ×) (A: Normal control; B: Negative control; C: HE4-siRNA)

2.3 HE4-siRNA 下調人卵巢癌細胞系 SK-OV-3的 HE4 表達對細胞侵襲的影響

Transwell 小室體外侵襲實驗顯示，平均每視野中的穿膜細胞數，正常對照組為（187.4 ±11.17）個，陰性對照組為（177.8 ± 9.76）個，HE4-siRNA 組為（21.8 ± 2.86）個，與正常對照組相比，HE4-siRNA 組穿膜細胞數顯著下降（P <0.01），計算侵襲抑制率為（88.3 ± 2.11）%，而陰性對照組和正常對照組兩組之間差異無統計學意義（P > 0.05）（圖 3，表 2）。

表2 HE4-siRNA 對卵巢癌 SK-OV-3 細胞侵襲的影響Table2 Effect of HE4-siRNA transfection on invasive ability of SK-OV-3 cells

3 討論

卵巢癌是婦科死亡率最高的惡性腫瘤，美國2012年 22280 人被診斷為卵巢癌，15500 人死亡[2]，主要原因是卵巢癌早期無癥狀，僅有不到25% 的卵巢癌能在 I 期病變局限于卵巢時診斷，大多數患者診斷時腫瘤已經擴散或轉移。2003年，Hellstr?m 等[6]發現了一個新的卵巢癌標記物——HE4（WFDC2），它在正常卵巢組織中不表達，而在卵巢癌組織和血清中濃度增高，診斷的靈敏度與CA125 類似，但是在與卵巢良性病變鑒別時特異度比 CA125 更高。

HE4 蛋白核心含有四個二硫鍵組成的 WAP結構域，含有該結構域的蛋白家族一般具有蛋白酶抑制劑的功能。HE4 最初在附睪上皮被發現，推測其功能可能與精子成熟有關[3]。繼而 cDNA 雜交分析和基因表達序列分析（SAGE）顯示與正常組織相比，HE4 在卵巢癌組織高表達，提出 HE4 可能是卵巢癌的潛在標記物[4-5]。Hellstr?m 等[6]制備了抗 HE4 的單克隆抗體，建立了檢測血清 HE4 的方法，發現卵巢癌患者血清 HE4 水平升高，提出HE4 是一個優秀的血清腫瘤標記物，有助于卵巢癌早期診斷和與卵巢良性病變的鑒別診斷。此后，HE4檢測在卵巢癌臨床診治中的研究成為熱點，大量研究表明，HE4 是一個優秀的鑒別卵巢良惡性病變的生物標記物[7]，薈萃分析顯示 HE4 鑒別診斷卵巢癌和良性病變混合靈敏度（pooled sensitivity）為0.74，混合特異度（pooled specificity）為 0.87[8]。因此，2009年，FDA 結合 CA125、HE4 檢測和絕經情況提出了惡性腫瘤的風險算法（risk of malignancy algorithm，ROMA），用于盆腔腫物的良惡性鑒別，使用該算法，93.8% 的上皮性卵巢癌被正確鑒別診斷[9]。

近年來的研究發現，HE4 水平與卵巢癌 FIGO分期、分級相關，HE4 水平升高與卵巢癌侵襲性，預后不良和總生存率相關[10-12]。并且 HE4 可用于監測卵巢癌復發，Schummer 等[13]研究表明，晚期卵巢癌，經過手術和化療，在復發前 4.5 個月即有HE4 升高。Plotti 等[14]的前瞻性病例對照研究顯示，當截斷值為 70 pmol/L 時，HE4 監測卵巢癌復發的靈敏度為 74%，特異度 100%。

以上對 HE4 的臨床研究提示，HE4 可能參與卵巢癌的發生、發展、侵襲、轉移、復發等多個環節，但對 HE4 基因功能的研究目前尚罕見。RNA干擾是近年來興起的研究生物基因表達、調控與功能的一項新技術，小分子干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）是長度為 21～23 個核苷酸的短雙鏈 RNA，能特異性結合、降解細胞內相應序列mRNA，從而阻止或降低 mRNA 的翻譯。本研究中，用脂質體法將針對 HE4 基因設計的 siRNA轉染人卵巢癌 SK-OV-3 細胞系，通過實時定量PCR 和 Western blot 方法分析細胞內 HE4 mRNA和蛋白表達水平，發現 HE4-siRNA 能有效地特異性下調卵巢癌細胞內 HE4 mRNA 和蛋白表達，進而可以研究 HE4 在卵巢癌發生發展、侵襲轉移中的功能。

本研究結果表明，siRNA 特異性下調 HE4 表達后，可顯著抑制人卵巢癌 SK-OV-3 細胞增殖，細胞的增殖活力下降約 40%。體外侵襲實驗顯示，40 nmol/L HE4-siRNA 轉染卵巢癌 SK-OV-3 細胞48 h 后，穿膜細胞數由正常對照組的（187.4 ±11.17）個下降為（21.8 ± 2.86）個（P < 0.01），侵襲抑制率為（88.3 ± 2.11）%。而同時轉染非特異序列的陰性對照組和正常對照組之間差異無統計學意義（P > 0.05）。以上結果表明，有效下調卵巢癌細胞 HE4 表達后，可顯著抑制細胞增殖和侵襲，提示 HE4 可能在卵巢癌發生、發展和侵襲轉移的多個環節起重要作用。以上細胞學研究結果與 HE4臨床研究相符合。卵巢癌的侵襲和轉移是多因素、多步驟協同作用的結果，HE4 在此過程中具體生物學作用和調控機制還有待進一步研究。

綜上所述，卵巢癌細胞 HE4 被特異性抑制后，可有效降低人卵巢癌細胞的增殖和侵襲能力，提示HE4 有可能成為卵巢癌轉移防治的潛在靶點。

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