補(bǔ)腎健脾中藥對(duì)骨質(zhì)疏松癥小鼠骨骼、骨骼肌異檸檬酸脫氫酶影響的研究＊

李 佳，楊 芳，鄭洪新△，王擁軍

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，沈陽(yáng) 110847;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)脊柱病研究所骨代謝疾病研究室，上海 200032)

骨質(zhì)疏松(osteoporosis)是以骨組織顯微結(jié)構(gòu)受損、骨礦成分和骨基質(zhì)等比例不斷減少、骨質(zhì)變薄、骨小梁數(shù)量減低、骨脆性增加的一種全身骨代謝障礙疾病。骨質(zhì)疏松癥不僅會(huì)引發(fā)腰背酸痛、乏力、肢體麻木等不適癥狀，更使骨折發(fā)生的幾率增高，降低人們生活質(zhì)量。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)骨質(zhì)疏松癥小鼠骨骼、骨骼肌異檸檬酸脫氫酶的變化，以觀察骨骼肌收縮與骨骼協(xié)調(diào)性對(duì)骨質(zhì)疏松癥形成的影響，從而闡釋骨質(zhì)疏松癥“骨肉不相親”的病理機(jī)制。同時(shí)，通過(guò)比較和觀察補(bǔ)腎、健脾、活血法干預(yù)后對(duì)異檸檬酸脫氫酶的效應(yīng)，探討中醫(yī)防治骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、環(huán)境及飼料

8周齡OPG基因敲除小鼠36只(品系C57BL/6J)，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院脊柱病研究所引進(jìn)。另設(shè)正常C57BC小鼠8只作為正常組，普通飼料喂養(yǎng)，體質(zhì)量18～20 g，飼養(yǎng)條件為2級(jí)，室溫保持在22～24℃，相對(duì)濕度50%。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 異檸檬酸脫氫酶試劑盒由美國(guó)ADL公司提供(生產(chǎn)批號(hào)為79782)。

1.2.2 儀器 微孔板酶標(biāo)儀(型號(hào)為550，美國(guó)伯樂(lè)公司)。

1.3 藥物

補(bǔ)腎中藥由淫羊藿、活性馬鹿茸、牡蠣組成;健脾中藥為補(bǔ)中益氣顆粒，由北京漢典制藥有限公司提供(生產(chǎn)批號(hào)為090101);對(duì)照藥福善美，由杭州默沙東制藥有限公司提供(生產(chǎn)批號(hào)為J20080073)。

1.4 造模及給藥

1.4.1 造模 小鼠護(hù)骨素(OPG)基因敲除后，喂養(yǎng)6周，經(jīng)雙能X線骨密度儀測(cè)小鼠骨密度，確定小鼠造模成功。

1.4.2 分組 除正常組外，將OPG基因敲除小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型對(duì)照組(模型組)、補(bǔ)腎中藥組(補(bǔ)腎組)、健脾中藥組(健脾組)、活血化瘀中藥組(活血組)和對(duì)照藥組(福善美組)5組。

1.4.3 給藥方法 正常組、模型組給予生理鹽水0.5 mL;補(bǔ)腎組、健脾組、福善美組用藥量按成人與小鼠的體質(zhì)量折算系數(shù)9.01折算(成人體質(zhì)量按60 kg計(jì)算)，容積為1 mL/100 g體質(zhì)量，補(bǔ)腎組給藥量為鹿茸0.32 g/kg/d，牡蠣0.256 g/kg/d，淫羊藿0.126 g/kg/d;健脾組給藥量0.901 g/kg/d，福善美給藥量1.5016 mg/kg/d。實(shí)驗(yàn)期間，各組小鼠每周稱重1次，并根據(jù)體質(zhì)量變化調(diào)整給藥劑量。

1.5 標(biāo)本采集及檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)小鼠最后1次灌胃后，禁食24 h，經(jīng)10%水合氯醛注射麻醉(0.3 mL/100 g體質(zhì)量)后用碘伏消毒手術(shù)部位，剪開(kāi)腹腔后立即取出大鼠右后肢腓腸肌的白肌部分和左后肢全股骨。將骨骼、骨骼肌分別放入約5倍于組織體積量的MSH緩沖液中清洗、擦干、稱重后，用剪刀剪碎置入勻漿瓶中;以500 rpm勻漿充分，將勻漿后的組織放入離心管中離心2000×g 10 min;提取上清液放入1 mLEP管中。具體檢測(cè)步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，選用單因素方差分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 中醫(yī)不同治法對(duì)骨保護(hù)素基因敲除小鼠骨骼肌中異檸檬酸脫氫酶含量影響比較

表1顯示，骨保護(hù)素基因敲除小鼠骨骼肌異檸檬酸脫氫酶檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常組比較，其他各組小鼠骨骼肌的異檸檬酸脫氫酶顯著降低(P＜0.01);與模型組比較，補(bǔ)腎組、福善美組小鼠骨骼肌的異檸檬酸脫氫酶明顯升高(P＜0.01);健脾組升高程度也比較明顯，但與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，活血組統(tǒng)計(jì)學(xué)角度無(wú)改變。

2.2 中醫(yī)不同治法對(duì)骨保護(hù)素基因敲除小鼠骨骼中異檸檬酸脫氫酶含量影響比較

表1 各組小鼠骨骼肌中異檸檬酸脫氫酶含量比較(±s)

表1 各組小鼠骨骼肌中異檸檬酸脫氫酶含量比較(±s)

注:與正常組比較:*P＜0.01;與模空組比較:▲P＜0.01;與補(bǔ)腎組比較:#P＜0.01

組別 小鼠數(shù) 異檸檬酸脫氫酶濃度(mg/L)16.363±1.92模型對(duì)照組 8 5.521±0.44*補(bǔ)腎中藥組 7 9.888±1.06＊▲健脾中藥組 7 6.021±0.49*#福 善 美 組 7 12.482±1.31正常組8＊▲

表2顯示，骨保護(hù)素基因敲除小鼠骨骼異檸檬酸脫氫酶檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組、補(bǔ)腎組、健脾組和活血組小鼠骨骼的異檸檬酸脫氫酶顯著降低(P＜0.01)，福善美組與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.01);與模型組比較，補(bǔ)腎組、福善美組小鼠骨骼的異檸檬酸脫氫酶明顯升高(P＜0.01);健脾組升高程度也比較明顯，但與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;活血組統(tǒng)計(jì)學(xué)角度無(wú)改變。

表2 各組小鼠骨骼中異檸檬酸脫氫酶含量的比較(±s)

表2 各組小鼠骨骼中異檸檬酸脫氫酶含量的比較(±s)

注:與正常組比較:*P＜0.01;與模型組比較:▲P＜0.01;與補(bǔ)腎組比較:#P＜0.01

組別 小鼠數(shù) 異檸檬酸脫氫酶濃度(mg/L)16.329±1.01模型對(duì)照組 8 5.161±0.28*補(bǔ)腎中藥組 7 9.767±0.74＊▲健脾中藥組 7 5.563±0.38*#福 善 美 組 7 17.321±1.47正常組8＊▲

3 討論

3.1 骨骼與肌肉的失調(diào)性對(duì)骨質(zhì)疏松癥影響

骨骼為肌肉提供附著部位，肌肉收縮帶動(dòng)骨骼完成動(dòng)作，兩者相互協(xié)同，構(gòu)成骨骼和肌肉系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)構(gòu)成形體、支撐質(zhì)量、保護(hù)內(nèi)臟、運(yùn)動(dòng)等作用。有研究表明，肌肉力量和緊張度變化可作為臨床骨質(zhì)疏松癥形成與否的前瞻指標(biāo)［1］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“腎主骨”、“脾主肌肉四肢”，《內(nèi)經(jīng)》中充分論述和強(qiáng)調(diào)腎與骨、脾與肌肉的關(guān)系，可見(jiàn)先天之本(腎)與后天之本(脾)在骨骼、肌肉生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著決定性影響和作用。而水土兩臟“先天之本”與“后天之本”的相互聯(lián)系，也蘊(yùn)含和表現(xiàn)在其各自所主的器官(骨骼和肌肉)之間，亦即“骨不濡則肉不能著也，骨肉不相親則肉軟卻”之意。

3.2 異檸檬酸脫氫酶標(biāo)識(shí)的肌肉狀態(tài)與骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系

人體肌肉運(yùn)動(dòng)的過(guò)程伴隨著能量代謝的過(guò)程，為獲取肌肉活動(dòng)所需要的能量，機(jī)體任何輕微的活動(dòng)都可提高代謝率，而獲取肌肉活動(dòng)所需能量的主要方式即為三羧酸循環(huán)。異檸檬酸脫氫酶是三羧酸循環(huán)過(guò)程中重要的調(diào)節(jié)酶之一，在能量代謝和生物合成代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。其活性在骨骼肌組織中表達(dá)越高，說(shuō)明能量代謝越旺盛［2］。研究表明，異檸檬酸脫氫酶在線粒體中受Ca2+調(diào)節(jié)，亦有研究表明，Mg2+濃度對(duì)其受Ca2+影響的敏感性有至關(guān)重要的作用。［3］

3.3 補(bǔ)腎健脾中藥對(duì)骨質(zhì)疏松癥的防治作用

骨質(zhì)疏松癥屬于中醫(yī)“骨痿”、“骨痹”范疇，髓道空虛，骨空、骨虛而不堅(jiān)首當(dāng)責(zé)之于腎，腎精虧虛，不足以榮養(yǎng)骨及骨髓，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。在“腎藏精”、“腎主骨生髓”理論指導(dǎo)下，本研究補(bǔ)腎組用藥選用鄭洪新教授多年科研及臨床實(shí)踐總結(jié)的補(bǔ)腎填精中藥復(fù)方鹿茸、牡蠣、淫羊藿，通過(guò)補(bǔ)腎填精，精足則髓滿，髓實(shí)則骨充。腎精源于先天之精，又由后天之精的不斷充養(yǎng)，因此腎精不足亦與后天脾胃化生功能密切相關(guān)。本研究選用補(bǔ)益脾胃的代表方劑補(bǔ)中益氣顆粒，在OPG敲除小鼠體內(nèi)觀察健脾方藥的治療效果。結(jié)果表明，補(bǔ)腎填精中藥和健脾中藥對(duì)骨骼及骨骼肌中異檸檬酸脫氫酶的表達(dá)都有不同程度的影響，提示先天之精和后天之精共同維持腎中精氣的充盛與否，進(jìn)而調(diào)節(jié)骨的代謝狀態(tài)，值得臨床治療借鑒和參考。另一方面，“腎主骨”、“脾主肌肉”，通過(guò)調(diào)節(jié)骨骼和肌肉的協(xié)調(diào)性，也對(duì)臨床治療骨質(zhì)疏松癥有積極的指導(dǎo)意義。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，骨質(zhì)疏松癥模型小鼠骨骼、骨骼肌的異檸檬酸脫氫酶濃度均與正常組比較顯著降低，說(shuō)明骨質(zhì)疏松癥形成后，骨骼、骨骼肌功能下降，能量代謝顯著降低。觀察中醫(yī)不同治法對(duì)糾正骨質(zhì)疏松癥的影響，補(bǔ)腎方法能顯著提高骨骼、骨骼肌的異檸檬酸脫氫酶濃度，說(shuō)明補(bǔ)腎法能顯著改善骨質(zhì)疏松癥小鼠骨骼和骨骼肌運(yùn)動(dòng)和功能狀態(tài)，維持相對(duì)較高水平的能量代謝。健脾組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，骨骼、骨骼肌的異檸檬酸脫氫酶濃度有所提高，雖與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但可以看出健脾方法有提高骨骼、骨骼肌異檸檬酸脫氫酶濃度的趨勢(shì)。活血組異檸檬酸脫氫酶與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)骨質(zhì)疏松小鼠骨骼和骨骼肌功能無(wú)改善。本實(shí)驗(yàn)與前期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一定程度證實(shí)，補(bǔ)腎法能夠有效改善和維持骨質(zhì)疏松癥患者骨骼和肌肉的功能，有效防止肌肉萎縮，預(yù)防骨折的發(fā)生。臨床應(yīng)用健脾法可作為補(bǔ)腎法的輔助用藥，以濡養(yǎng)肌肉，促進(jìn)骨生成，協(xié)助補(bǔ)腎中藥改善預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥。

［1］ToniRikkonen， Joonas Sirola ， KariSalovaara， Marjo Tuppurainen， Jukka S. Jurvelin， Risto Honkanen， Heikki Kr9ger，-Muscle Strength and Body Composition Are Clinical Indicators of Osteoporosis［J］.Calcif Tissue Int，2012，91:131-138.

［2］Korinna Huber，Johanna Petzold，Charlotte Rehfeldt，Klaus Ender，Ilse Fiedler，-Muscle energy metabolism:structural and functional features in different types of porcine striated muscles［J］.J Muscle Res Cell Motil，2007，28:249-258.

［3］G.A.Rutter，R.M.Denton，Rapid purification of pig heart NAD+-isocitrate dehydrogenase-Studies on the regulation of activity by Ca2+，adenine nucleotides，Mg2+and other metal ions［J］.Biochem.J，1989，263(2):445-452.