梔子苷對擬缺血損傷腦微血管內皮細胞EDNRB表達的影響＊

李芳赫，李興廣△，李衛紅△，李 峰，郭曉謹，萬亮琴，張 賽，臧妍妍，張林朋，馬家寶，姜昭妍

(1.北京中醫藥大學，北京 100029;2.通州中西醫結合醫院，北京 101100;3.濰坊醫學院，山東 濰坊 261000)

近年來研究發現，梔子苷能夠通過多種途徑有效抑制腦缺血的發生發展，具有明顯的抗炎與抗血栓作用［1，2］。前期實驗基因芯片檢測發現，梔子苷對擬缺血損傷腦微血管內皮細胞內皮素受體B(endothelin receptor B，EDNRB)基因表達具有顯著下調作用。因此，本實驗在前期研究的基礎上，觀察了梔子苷對擬缺血腦微血管內皮細胞EDNRB mRNA及蛋白表達水平的調節作用，一方面對基因芯片的結果進行驗證，同時進一步深入揭示了梔子苷發揮腦保護作用的分子機制。

1 實驗方法

1.1 大鼠腦微血管內皮細胞的培養

采用實驗室已建立的腦微血管內皮細胞培養方法［3］，進行內皮細胞原代取材、分離純化和培養。本實驗使用第3代內皮細胞。

1.2 擬缺血損傷模型的制備

采用本實驗室已建立的糖氧剝奪模型［4］，用無糖的Kreb’s液置換原培養基，放入低氧培養箱(氣體含量為 94%N2，5%CO2，1%O2)，37℃繼續培養 6 h。

1.3 梔子苷用藥濃度的確定

將第3代腦微血管內皮細胞接種于96孔板，置培養箱中繼續培養，48 h后細胞呈70%匯合狀態，分為9組:正常組、模型組、7個給藥組(梔子苷分別按8.3、16.6、33.2、66.4、132.8、265.6、531.2 μg/ml濃度給藥)，除正常組外其余8組按上述方法復制模型，即糖氧剝奪損傷6 h，各給藥組在造模前3 h和造模中給藥，造模結束后用CCK-8試劑盒檢測細胞活性，篩選出梔子苷的最佳給藥濃度進行后期實驗。

1.4 實驗分組與處理

培養的腦微血管內皮細胞分成3組，分別為正常組、模型組、梔子苷組。除正常組外其余2組進行造模，梔子苷組按上述實驗篩選出的用藥濃度進行給藥，處理結束后進行下列指標檢測。

1.5 CCK-8法檢測細胞活性

每孔加入10 μl CCK-8溶液，在培養箱中繼續孵育2 h后，用酶標儀測定各組的吸光光度值，檢測波長為450 nm，每組設6個復孔。

1.6 實時熒光定量 PCR法檢測 EDNRB mRNA表達水平

各組細胞加入1 ml的Trizol，抽提總RNA，測定RNA濃度。然后用逆轉錄試劑盒反轉錄RNA生成單鏈cDNA，采用SYBR GreenⅠ定量PCR試劑盒，在7500型實時定量PCR儀上檢測EDNRB基因的mRNA表達水平。基因表達變化倍數采用 2-ΔΔCt計算。計算公式如下:ΔCt=Ct目的基因–Ct內參;ΔΔCt=ΔCt實驗組–ΔCt對照組。定量PCR所用引物如下:EDNRB上游5'-CTGTCCCTGAAGCCATA GGT-3'，下游 5'-GAATCCTGCTGAGGTGAAGG-3';β-actin，上游 5'-CGCG AGAAGATGACCCAGAT-3'，下游5'-GCACTGTGTTG GCGTACAGG-3'。

1.7 Western blotting法檢測各組細胞EDNRB蛋白的表達水平

各組細胞內加入細胞裂解液，冰上裂解約20 min后離心取上清，BCA法檢測蛋白定量。樣品按體積比加入5×上樣緩沖液，熱水浴煮沸5 min將其變性后進行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，用濕轉法將凝膠中蛋白轉至聚二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，5%的脫脂奶粉37℃封閉1 h，加EDNRB抗體，4℃孵育過夜，次日洗膜后加入相應二抗(1∶5000稀釋)，37℃孵育2 h，ECL法顯影，利用凝膠圖像處理系統拍照并分析條帶灰度值。

1.8 統計學方法

應用SPSS 20.0軟件進行統計分析，實驗數據以均數±標準差(±s)表示，數據分析采用單因素方差分析和t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度梔子苷對擬缺血損傷內皮細胞活性的影響

圖1顯示，與對照組比較，模型組OD值顯著降低(P＜0.01)，表明氧糖剝奪造成內皮細胞受到損傷，活性下降。與模型組比較，梔子苷低濃度階段，隨著濃度的增加，微血管內皮細胞活性逐漸增強，33.2 μg/ml濃度組達到最高峰，OD 值明顯高于模型組(P ＜0.01)，66.4 μg/ml濃度組 OD 值與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。之后隨濃度繼續增加，內皮細胞活性反而下降，因此選用33.2 μg/ml作為下一步實驗的用藥濃度。

2.2 梔子苷對擬缺血腦微血管內皮細胞EDNRB mRNA水平的影響

圖2顯示，與正常組比較，模型組 EDNRB mRNA水平顯著增高(P＜0.05)，提示擬缺血損傷可誘導腦微血管內皮細胞內皮素受體B mRNA水平的高表達;與模型組比較，梔子苷組EDNRB基因表達顯著降低(P＜0.05)，且梔子苷組與正常組比較差異無統計學意義(P＞0.05)，提示梔子苷對EDNRB mRNA有顯著下調作用。

2.3 梔子苷對擬缺血腦微血管內皮細胞EDNRB蛋白表達的影響

圖3顯示，Western blotting檢測EDNRB蛋白表達情況，正常組內皮細胞EDNRB的表達量較少，造模后，EDNRB表達顯著增多(P＜0.05)，梔子苷能顯著下調EDNRB蛋白表達。定量分析顯示，與模型組比較，梔子苷組灰度值顯著降低，組間比較差異有統計學意義(P＜0.05)，與實時-定量PCR結果基本一致。

圖1 不同濃度梔子苷對擬缺血損傷內皮細胞活性的影響

圖2 梔子苷對擬缺血腦微血管內皮細胞中EDNRB mRNA水平的影響

圖3 梔子苷對擬缺血腦微血管內皮細胞EDNRB蛋白表達的影響

3 討論

內皮素(endothelin，ET)是由血管內皮細胞培養液中分離純化的一種活性肽，開始僅作為一種血管收縮物質進行研究。隨著研究深入人們逐漸發現，內皮素的生物活性遠遠超過最初的認識，在生物體內具有廣泛的生物作用。內皮素需要通過與內皮素受體結合，才能表達其生物學作用。研究顯示，ET及其受體廣泛分布于腦微血管內皮細胞、神經元及星形膠質細胞等中樞神經系統［5］，與缺血性腦血管的發生發展關系密切。目前，用分子克隆方法在人體已鑒定出2種ET受體，即ET-A受體和ET-B受體［6］。ET-B受體主要分布于血管內皮細胞和平滑肌細胞。一般認為，表達于血管內皮細胞的ET-B受體在病變過程中具有介導內皮素的清除、血管舒張以及調節細胞增殖或凋亡等作用［7］，似乎作為“保護性受體”發揮作用。然而近期的研究顯示，ET-B受體可能具有更為廣泛的生物作用。ET-B受體與ET-A受體都屬于G蛋白偶聯受體家族，有著共同的胞內信號傳導通路。如刺激磷脂酶C激活，產生三磷酸肌醇和二酰甘油，以及導致細胞內鈣離子增多及離子通道開放等，提示2種類型的受體可能共同介導ET的某些生物功能。另一方面，ET-B受體與ET-A受體不同，ET-B受體激活后同時促進磷脂酶A2激活，進而釋放前列腺素(prostaglandin，PG)和血栓素 A2(thromboxane A2，TXA2)［8］，PGs和TXA2除調節血管舒縮外，均為炎癥反應物質，提示ET-B受體可能與介導炎癥反應有關。不斷有文獻報道，大鼠腦缺血血管中的 ET-B受體上調。Zhang等人研究發現，內皮素B受體激活后可誘導肺血管內皮細胞的單核細胞趨化因子CXCL3表達，引起單核細胞聚集［9］，提示ETB受體激活后可能誘導炎癥反應的產生，進一步起到加重腦缺血損傷的病理作用。

梔子苷是梔子果實中的主要成分之一，又稱京尼平苷。前期研究顯示，梔子苷在缺血性腦損傷中具有保護血管內皮細胞、抗炎、抗氧化應激、抑制血小板活化與聚集等作用［10］。本實驗中，我們首先利用氧糖剝奪模型觀察了梔子苷作用于擬缺血損傷內皮細胞的量效關系，發現該藥的藥效與用藥濃度之間并非線性關系，開始隨著藥物濃度的增加，使內皮細胞活性逐漸增強，即保護作用增強，33.2 μg/ml濃度時達高峰，之后隨著用藥濃度的增加，保護作用反而下降，故選用此濃度進行了后續實驗。從RTPCR及western blotting結果來看，內皮細胞造模后，ETB受體的表達明顯增加，梔子苷從mRNA及蛋白水平均可顯著下調ETB受體的高表達。綜上可知，內皮細胞ETB受體激活可介導單核細胞趨化因子以及其他炎癥相關因子的表達，啟動或加重炎性損傷。因此，梔子苷抑制擬缺血損傷中ETB受體的表達，提示可能是梔子苷在腦缺血性損傷中發揮抗炎作用的內在機制之一。

［1］Liu HT，He JL，Li WM，et al.Geniposide inhibits interleukin-6 and interleukin-8 production in lipopolysaccharide-induced human umbilical vein endothelial cells by blocking p38 and ERK1/2 signaling pathways［J］.Inflamm Res，2010，59(6):451-461.

［2］張海燕，鄔偉魁，楊軍宣，等.梔子對心腦血管系統的作用研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17(14):294-298.

［3］李衛紅，李澎濤，華茜，等.不同內皮細胞條件培養液對皮層神經元線粒體功能的影響及通絡救腦注射液的保護作用［J］.中國中西醫結合雜志，2007，27(2):131-134.

［4］朱元，李澎濤，李衛紅，等.不同狀態的大鼠星形膠質細胞條件培養液對腦微血管內皮細胞血腦屏障特征性酶的影響［J］.世界科學技術(中醫藥現代化)，2012，14(2):1393-1398.

［5］Leonard MG，Gulati A.Endothelin B receptor agonist，IRL-1620，enhances angiogenesis and neurogenesis following cerebral ischemia in rats［J］.Brain Res，1528:28-41.

［6］任年軍.內皮素與腦缺血［J］.國外醫學·神經病學神經外科學分冊，2001，28(4):291-293.

［7］王蔭槐.內皮素和一氧化氮對前列腺平滑肌張力的調節作用［J］.國外醫學·泌尿系統分冊，1997，17(01):17-20.

［8］Aramori I，Nakanishi S.Coupling of two endothelin receptor subtypes to differing signal transduction in transfected Chinese hamster ovary cells［J］.J Biol Chem，1992，267:12468-12474.

［9］Zhang J，Yang W.Endothelin-1 activation of the endothelin B receptor modulates pulmonary endothelial CX3CL1 and contributes to pulmonary angiogenesis in experimental hepatopulmonary syndrome［J］.Am J Pathol，184(6):1706-1714.

［10］那莎，郭國田，王宗殿，等.梔子及其有效成分藥理研究進展［J］.中國中醫藥信息雜志，2005，12(1):90-92.