nPKC－PKD3信號(hào)傳導(dǎo)途徑介導(dǎo)Prostratin活化HIV－1轉(zhuǎn)錄

王會(huì)平，劉 敏，劉潤忠

（廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 廈門361102）

艾滋病在全球范圍內(nèi)流行多年，目前行之有效的治療方案稱之為高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法（HAART），即通常為大眾所熟知的“雞尾酒療法”［1－2］.“雞尾酒療法”主要針對艾滋病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶、蛋白酶以及外殼糖蛋白Gp41，因此它僅對患者體內(nèi)處于復(fù)制周期的活病毒療效顯著，用藥后患者血液中活病毒的滴度可降至無法檢測到的水平，無法徹底清除患者體內(nèi)的艾滋病毒；停藥后，患者的病情極易出現(xiàn)反復(fù)［2－3］.近年來人們提出一種新的治療策略［4］，用另外一類化合物刺激潛伏的艾滋病毒使其進(jìn)入復(fù)制周期，再聯(lián)用“雞尾酒療法”清除這些活病毒，以此來避免患者終生用藥的負(fù)擔(dān)并最終治愈艾滋病.雖然這種治療策略理論上存在可行性，但目前人們對于艾滋病毒潛伏和重新活化的理解還很有限，缺乏相應(yīng)的分子機(jī)制模型用于篩選這類活化潛伏病毒的化合物，從而造成臨床治療實(shí)踐的進(jìn)展緩慢［5－6］.因此，深入探討艾滋病毒的潛伏以及重新活化的分子機(jī)制已經(jīng)成為當(dāng)下研究人員所關(guān)注的焦點(diǎn).

在業(yè)已發(fā)現(xiàn)的、為數(shù)不多的能激活潛伏艾滋病毒的化合物中，Prostratin是研究最多的一種，它作為潛在的抗艾滋病藥物已進(jìn)入II期臨床試驗(yàn)［6－10］.Prostratin是不致癌的佛波酯類化合物，具備此類化合物的共性，即活化細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶C（PKC）信號(hào)通路［11］；該信號(hào)通路的核心蛋白PKC也被證實(shí)對活化免疫T細(xì)胞中潛伏的艾滋病毒起關(guān)鍵性的作用［9］.PKC家族包含3個(gè)亞型：典型PKC（tPKC，包括α、βI、βII和γ）、新型PKC（nPKC，包括δ、ε、η和θ）以及非典型PKC（aPKC，包括ζ和λ）.PKC家族所有成員的碳端都有相同的具催化活性的結(jié)構(gòu)域；氮端的差異則較大，便于結(jié)合不同的上游調(diào)控蛋白和下游效應(yīng)蛋白從而執(zhí)行不同的功能.當(dāng)胞外信號(hào)刺激細(xì)胞時(shí)，胞內(nèi)的磷脂酶C（PLC）首先活化并誘導(dǎo)產(chǎn)生第二信使——甘油二酯（DAG），隨后PKC活化并將信號(hào)傳遞給下游效應(yīng)分子諸如蛋白激酶D（PKD）以執(zhí)行相應(yīng)的生物學(xué)功能［12－13］.由于基因的轉(zhuǎn)錄活化是激活潛伏艾滋病毒的前提，因此Prostratin是否也是通過活化PKC信號(hào)途徑激活艾滋病毒的基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而活化潛伏的艾滋病毒成為亟待解決的問題.

本文選用穩(wěn)定表達(dá)HIV－LTR－Luciferase報(bào)告基因的 HeLa細(xì)胞（HIV－LTR－Luc細(xì)胞）為研究對象，用Prostratin和多種PKC抑制劑聯(lián)合處理細(xì)胞，證實(shí)了nPKC亞型參與Prostratin誘導(dǎo)的HIV－1轉(zhuǎn)錄活化，并最終通過效應(yīng)蛋白PKD3激活HIV－1轉(zhuǎn)錄的分子信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 材 料

PKC抑制劑 G?6976、G?6983和BIMI（G?6850）購自美國Calbiochem公司；Prostratin購自美國LC Laboratories公司；轉(zhuǎn)染試劑PEI購自美國Polysciences公司；熒光素酶底物購自美國Promega公司.持續(xù)活化型PKCθ、PKCε和PKCα的表達(dá)質(zhì)粒受贈(zèng)于美國華盛頓大學(xué) Andrew Matthews Scharenberg教授［14－15］；PKD3敲 低 質(zhì) 粒 （shPKD3）的 靶 序 列 為：5′－GTC CTA AGA CGG GAC TCT C［16］.

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理實(shí)驗(yàn)

HIV－LTR－Luc穩(wěn)定細(xì)胞株［17］培養(yǎng)在含10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）胎牛血清（FBS）的DMEM完全培養(yǎng)基中.藥物處理時(shí)細(xì)胞密度約為50%～70%，先用PKC抑制劑預(yù)處理1h，然后用2μmol／L的Prostratin繼續(xù)處理6h.藥物處理后，收集并裂解細(xì)胞用于熒光素酶活性分析.

1.2.2 熒光素酶活性分析

將HIV－LTR－Luc穩(wěn)定細(xì)胞株培養(yǎng)在六孔板里并用相應(yīng)的藥物處理.藥物處理后，細(xì)胞裂解液按照以前描述過的方案測量熒光素酶活性［18］，根據(jù)3次不同的實(shí)驗(yàn)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤差.

1.2.3 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前1d將HIV－LTR－Luc穩(wěn)定細(xì)胞株胞培養(yǎng)在六孔板里，細(xì)胞密度約為70%～90%.將2μg待轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒和3μL PEI溶液混勻后加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)48h.細(xì)胞裂解液按照以前描述過的方案測量熒光素酶活性［18］，根據(jù)3次不同的實(shí)驗(yàn)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤差.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 Prostratin刺激HIV－LTR－Luc的轉(zhuǎn)錄活化

為研究Prostratin激活HIV－1的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)而活化潛伏的艾滋病毒的分子機(jī)制，本文選用了HIVLTR－Luc穩(wěn)定細(xì)胞株.該細(xì)胞株構(gòu)建自HeLa細(xì)胞，它整合了由HIV－1長末端（LTR）啟動(dòng)子所調(diào)控的熒光素酶報(bào)告基因，其熒光素酶的表達(dá)水平直接反映HIV－1的轉(zhuǎn)錄活性［17－18］.

首先，用不同濃度的Prostratin處理細(xì)胞6h.如圖1所示，熒光素酶的表達(dá)水平隨Prostratin濃度上升而升高，即 HIV－1的轉(zhuǎn)錄活性也在不斷升高；當(dāng)Prostratin濃度為5μmol／L時(shí)，HIV－1轉(zhuǎn)錄水平提高100倍以上.為避免高劑量藥物衍生的毒理作用，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中Prostratin的處理濃度限定為2μmol／L.緊接著，在這一濃度條件下，測試了不同處理時(shí)間對HIV－1轉(zhuǎn)錄活性的影響.發(fā)現(xiàn)隨著處理時(shí)間的延長，HIV－1轉(zhuǎn)錄活性逐漸增強(qiáng)；用Prostratin處理細(xì)胞6h左右已經(jīng)能高效地激活HIV－1的轉(zhuǎn)錄（圖2）.由于細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄水平應(yīng)答外界信號(hào)刺激可在較短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)，而長時(shí)間藥物處理會(huì)帶來信號(hào)傳導(dǎo)過程中的次級(jí)應(yīng)答使得問題變得過于復(fù)雜，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中藥物處理時(shí)間限定為6h.

圖1 不同濃度的Prostratin處理后HIV－1的轉(zhuǎn)錄活性Fig.1 Prostratin activated gene expression from stably integrated HIV－LTR－luciferase reporter in a dose－dependent manner

2.2 Prostratin通過nPKC活化HIV－1的轉(zhuǎn)錄

此前其他實(shí)驗(yàn)室在Jurkat免疫T細(xì)胞中證實(shí)蛋白PKC參與Prostratin活化潛伏艾滋病毒的過程［9］，那么Prostratin激活HIV－1轉(zhuǎn)錄是否有蛋白PKC的參與呢？首先，我們采用3種不同的蛋白PKC的抑制劑預(yù)處理細(xì)胞再偶聯(lián)Prostratin刺激來觀察HIV－1的轉(zhuǎn)錄活性.如圖3所示，廣譜的PKC抑制劑G?6983和BIM I均能削弱Prostratin刺激引起的HIV－1的轉(zhuǎn)錄活化，而另1種PKC抑制劑G?6976卻沒有這個(gè)作用.仔細(xì)分析這3種PKC抑制劑的特異性，發(fā)現(xiàn)G?6983和 BIM I主 要 抑 制 tPKC 和 nPKC［19］，而G?6976只能抑制tPKC；這意味著nPKC可能參與Prostratin刺激的HIV－1的轉(zhuǎn)錄活化.接下來為進(jìn)一步證實(shí)這個(gè)推論，在HIV－LTR－Luc細(xì)胞中瞬時(shí)過表達(dá)了持續(xù)活化型的PKCθ、PKCε和PKCα.如圖4所示，其中2種nPKC均能直接激活HIV－1的轉(zhuǎn)錄活性，而tPKC則無此功能.因此，nPKC直接介導(dǎo)了Prostratin刺激引起的HIV－1的轉(zhuǎn)錄活化.

圖2 Prostratin處理不同時(shí)間后HIV－1的轉(zhuǎn)錄活性Fig.2 Time course of Prostratin－stimulated HIV－LTR－Luc expression

圖3 PKC抑制劑阻斷Prostratin活化的HIV－1轉(zhuǎn)錄Fig.3 Effect of PKC inhibitors on Prostratin－activated HIV－1expression

2.3 敲低效應(yīng)蛋白PKD3拮抗Prostratin刺激活化的HIV－1轉(zhuǎn)錄

圖4 3種PKC對HIV－1轉(zhuǎn)錄活性的影響Fig.4 Effect of overexpression of selected PKC isoforms on HIV－1expression

圖5 敲低PKD3削弱Prostratin活化的HIV－1轉(zhuǎn)錄Fig.5 The effect of shRNA knock－down on Prostratin－activated HIV－1expression

下游效應(yīng)蛋白是信號(hào)傳導(dǎo)過程中特定功能的執(zhí)行者.我們之前的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PKC信號(hào)途徑的效應(yīng)蛋白PKD最終影響HIV－1的轉(zhuǎn)錄活性［16］.PKD家族共有3個(gè)成員，前期的實(shí)驗(yàn)表明PKD3而非PKD1、PKD2介導(dǎo) HIV－1的轉(zhuǎn)錄活化［16］.因此，我們先用特異的shRNA敲低PKD3，然后再用Prostratin處理細(xì)胞觀察HIV－1的轉(zhuǎn)錄活性.PKD3被敲低以后（內(nèi)源性PKD3減少約50%）［16］，Prostratin刺激所引起的HIV－1轉(zhuǎn)錄活化倍數(shù)也相應(yīng)的減少一半左右（圖5）.這進(jìn)一步證明，Prostratin處理激活了nPKC－PKD3信號(hào)傳導(dǎo)途徑從而活化HIV－1的轉(zhuǎn)錄.

3 討 論

盡管Prostratin在臨床上的個(gè)別應(yīng)用已取得了一定的療效［20－21］，但具體的藥用機(jī)理仍不清楚，這顯著延緩了臨床廣泛的使用［6］.本文從分析HIV－1轉(zhuǎn)錄活性入手，以HIV證實(shí)nPKC－PKD3信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與Prostratin刺激引起的HIV－1轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng).本文所發(fā)現(xiàn)的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，為提速Prostratin大范圍應(yīng)用于臨床治療提供了可靠的基礎(chǔ)理論依據(jù)，同時(shí)也為日后構(gòu)建新的抗艾滋病藥物篩選模型以及藥物作用靶點(diǎn)提供了新的線索.

在本研究前，研究人員以攜帶潛伏HIV－1的免疫細(xì)胞為模型，初步將蛋白PKC與活化潛伏的艾滋病毒的現(xiàn)象相聯(lián)系［9］.然而，事實(shí)上該潛伏HIV－1細(xì)胞模型與真實(shí)的艾滋病毒潛伏過程存在明顯的區(qū)別［22］.首先，真實(shí)的艾滋病毒潛伏過程中，93%的HIV－1基因組會(huì)整合在宿主處于高度轉(zhuǎn)錄活化狀態(tài)的基因的內(nèi)含子區(qū)，因此可能是轉(zhuǎn)錄過程中相伴的RNA剪輯導(dǎo)致RNA聚合酶II直接滑過HIV－1的基因從而引起 HIV－1基因未被轉(zhuǎn)錄［23］；而潛伏 HIV－1細(xì)胞模型中，HIV－1基因更多整合在異染色體區(qū)，由于染色體空間結(jié)構(gòu)未被打開，該區(qū)的基因處于轉(zhuǎn)錄抑制狀態(tài)［24］.其次，真實(shí)的艾滋病毒潛伏多發(fā)生在免疫T細(xì)胞記憶細(xì)胞中，此類細(xì)胞處于細(xì)胞周期的靜息期，不生長也不分裂［25－26］；而潛伏 HIV－1細(xì)胞模型為常規(guī)的免疫T細(xì)胞，處于正常的細(xì)胞增殖周期，細(xì)胞快速生長并進(jìn)行有絲分裂［24］.因此，為規(guī)避細(xì)胞模型與真實(shí)過程之間的差異，同時(shí)將復(fù)雜的多因素協(xié)同實(shí)現(xiàn)的艾滋病毒潛伏過程簡化為簡單的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停x取了專門為研究HIV－1轉(zhuǎn)錄活性而設(shè)計(jì)的 HIV－LTR－Luc細(xì)胞模型.因?yàn)闈摲麳IV－1活化的源頭就是潛伏的HIV－1退出靜息狀態(tài)，開始第1輪HIV－1基因的轉(zhuǎn)錄.當(dāng)最初的轉(zhuǎn)錄以及翻譯完成后，新生的病毒蛋白如Tat會(huì)強(qiáng)烈刺激后續(xù)的轉(zhuǎn)錄過程，從而最終促使艾滋病迅猛復(fù)發(fā).

在過去10余年的研究中，我們采用HIV－LTRLuc細(xì)胞模型已經(jīng)成功詮釋過處于復(fù)制周期中的活病毒的轉(zhuǎn)錄機(jī)制，即憑借病毒蛋白Tat綁架宿主轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中的核心分子正性轉(zhuǎn)錄延伸因子b（P－TEFb），并進(jìn)一步利用P－TEFb能刺激基因轉(zhuǎn)錄延伸的性能，方便HIV－1可以順利合成完整的全基因產(chǎn)物［27－29］.對于潛伏的艾滋病毒而言，由于第1輪轉(zhuǎn)錄都沒有啟動(dòng)，活病毒轉(zhuǎn)錄所倚重的病毒蛋白Tat還沒有產(chǎn)生，潛伏的HIV－1只能更多依賴于轉(zhuǎn)錄因子 NFκB［9］.轉(zhuǎn)錄因子NFκB會(huì)募集Brd4－P－TEFb蛋白復(fù)合體（由蛋白Brd4與P－TEFb相互作用形成的蛋白復(fù)合體）到HIV－1啟動(dòng)子區(qū)的NFκB結(jié)合位點(diǎn)附近，通過P－TEFb激活RNA聚合酶II完成第1輪HIV－1基因的轉(zhuǎn)錄.有報(bào)道指出PKD可以調(diào)控NFκB.活化的PKD通過磷酸化激活I(lǐng)KK復(fù)合體，活化了的IKK會(huì)促進(jìn)NFκB抑制蛋白IκB的泛素化降解，從而通過去抑制作用激活轉(zhuǎn)錄因子NFκB.因此當(dāng)Prostratin刺激所產(chǎn)生的應(yīng)答信號(hào)傳遞到效應(yīng)蛋白PKD3以后，PKD3作為PKC信號(hào)傳導(dǎo)途徑與NFκB信號(hào)傳導(dǎo)途徑的整合點(diǎn)，最終改變了潛伏HIV－1的轉(zhuǎn)錄活性.

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