利用骨科電鋸建立兔橈骨骨折模型的研究

李長雷

（江漢大學醫學院，湖北 武漢430056）

馬寶苗

（江漢大學武漢生物醫學研究院，湖北 武漢430056）

陳曉青，楊友華，易卉玲，黃麗霞，黃丹

（江漢大學醫學院，湖北武漢430056）

鐘守昌

（江漢大學教務處，湖北 武漢430056）

骨折愈合是一個非常復雜的骨再生過程，涉及到多種細胞及細胞間質，大量蛋白質、成千上百種基因的表達。他們相互協調、共同作用，導致了骨結構的完整性和骨強度的恢復［1］。

研究骨折愈合的機制和促進骨折愈合的方法，建立理想的動物骨折模型是非常必要的。模型制備是否科學合理直接關系到實驗結果的科學性、可靠性及可重復性［2－3］。經過前人長期的探索與總結，目前在科研中作為建模對象的動物有很多，如犬［4］、牛［5］、鼠［6－7］、豬［8］及兔等，實驗兔橈骨骨折模型就是其中一類［9－11］。制作兔橈骨骨折模型的方法有很多種，與傳統方法中使用鈍器直接猛烈敲擊預造模部位以達到骨折的目的相比較，利用骨科電鋸制作的兔橈骨骨折模型成功率高，機體所受創傷小。在此基礎上，為了檢測低頻電磁場和低強度超聲波治療在單獨和聯合作用情況下對骨折損傷修復效果和對修復療效建立評價體系，研究人員利用骨科電鋸，選取兔建立一個理想的橈骨骨折模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

普通級成年健康日本大耳白兔30只（實驗動物質量合格證編號：NO.42010000000194），平均體質量2～2.5kg，雌雄各半，常規單籠飼養，自由進食和飲水，飼料為全價顆粒料。實驗過程在江漢大學實驗動物中心完成 ［實驗動物使用許可證編號：SYXK（鄂）2007－0042］。

對實驗動物的處理方法均嚴格遵守國家科技部頒發的 《關于善待實驗動物的指導性意見》之規定［12］。

1.2 試劑與儀器

PX－100CLK型移動式醫用診斷X射線機（東芝／上海醫療器械廠有限公司）；小型骨科電鋸（江漢大學附屬醫院提供）；戊巴比妥鈉：含量≥99.0%，25g／瓶，批號：WS20120112，即配即用，江漢大學醫學院藥理教研室提供。

1.3 模型制作

兔適應性飼養1周后，隨機分為7d、14d和21d三組，每組10只。造模過程：兔經耳緣靜脈注射濃度為2.5% 的戊巴比妥鈉（1ml／kg），麻醉后，放置經消毒后的外科手術臺，在雙前肢內側橈骨中段處剪毛、消毒、備皮，再經活力碘消毒，無菌條件下，通過手術方式切開皮膚，剝離周圍軟組織和血管，露出橈骨。用直徑為2cm、厚度為0.2cm的小型骨科電鋸沿橈骨垂直方向造成中段不完全橫斷骨折，骨折處寬度為0.2cm，深度為橈骨的2／3，止血、清創、縫合皮膚，不予固定（圖1a～d）。兔術后分籠飼養，每只動物每日1次經耳緣靜脈注射青霉素40萬U預防感染，共持續3d。

圖1 橈骨骨折模型制作過程

1.4 觀察指標

造模總時長為21d。在造模后分別對7d、14d和21d組兔造模部位橈骨進行X光照射取片，之后取材造模部位橈骨進行組織病理學檢查，在動態的情況下觀察不同時段骨折自行修復的情況。

1.4.1 X光照射取片 用PX－100CLK型移動式醫用診斷X射線機進行X光攝片，采用的電壓為55KV，電流量為125mA，焦距為81cm，曝光時間為1.1ms。在麻醉狀態下進行X光拍片，每一個前肢拍攝一張X光片，觀察兔骨折后的自行修復狀況。

1.4.2 組織病理學檢測 在對全部兔骨折部位進行X光照射取片后，處死家兔，立即以雙前肢橈骨骨折處為中心，取材長度為2cm的一段為標本，經10%甲醛溶液固定，再置于5%EDTA液中脫鈣，徹底沖洗，酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，平行于橈骨縱軸經橈骨中央過骨髓腔及兩側皮質切取厚約5mm的長軸切片3張作蘇木精－伊紅染色（HE染色），做組織病理學檢測，分析骨折造模效果［13］。

2 結果

2.1 X光照射結果

造模后觀察7d組，2只為骨折處完全斷裂，移位明顯，有小塊骨碎片（圖2a）。8只兔前肢橈骨中段顯示為不完全橫斷骨折，且骨折斷端橫截面較整齊，邊緣較清晰（圖2b）。無明顯骨膜反應；觀察14d組，大多數兔骨折斷端邊緣逐漸模糊不清，并伴有輕度骨膜反應，有少量骨痂（圖2c）；觀察第21d組，兔骨折斷端邊緣已基本接近消失，但仍可疑似觀察到，伴有較深骨膜反應，骨痂量增多，但未填滿缺損部位（圖2d）。

圖2 術后第7天、14天、21天動物骨折處X射線片

2.2 組織病理學檢測

造模后觀察7d組，骨折斷端部位淤血腫塊較大，形成少量肉芽腫；觀察14d組，骨折斷端部位淤血腫塊基本被吸收，有較多纖維及成纖維細胞連接，小血管增生尚不明顯。形成較多的肉芽腫；觀察21d組，纖維結締組織增生，軟骨細胞生成，小血管增生較多。

3 討論

在制作兔橈骨骨折模型的眾多方法中，傳統方法固然可以建立骨折模型，但是造模的效果較差：會出現骨折部位不準確、骨折范圍過大、骨碎片過多、傷及其他部位等現象；可能引發其他并發癥，對機體本身造成較大的傷害，不利于骨折的治療與分析。而利用骨科電鋸制作的兔橈骨骨折模型成功率高，定位準確，傷口范圍小，出血量少，易于縫合、消毒、觀察和治療，避免感染帶來的并發癥，機體易于恢復健康，有助于骨折治療方法的探索與研究。

本次實驗共使用兔30只，從拍攝的橈骨X光片和組織病理學結果分析，全部造模動物均發生了骨折現象，其中2只因不符合造模要求外，其余兔橈骨骨折模型均取得成功。說明利用骨科電鋸制作兔橈骨骨折模型的方法具有很高的成功率。在造模后3周內，動態的觀察兔在骨折后的不同時段，均發生了自行修復現象。但這類現象發生的時間有先后，這屬于動物個體差異性的表現。

與其它動物相比，用兔建立骨折模型有以下優點更適于造模：①兔的四肢屬于長骨，長骨通常是指上肢橈骨或者下肢脛骨，其骨質結構與人類相似度較高［14］。相比較與脛骨，橈骨只有皮膚和少量筋膜覆蓋，少血管，橈骨頭周緣有環狀關節面，下方光滑；下端特別膨大，近似立方形；更容易分離和暴露；且對機體造成的損傷較小，減少對骨折愈合的影響。②兔的骨骼轉化速度快，約達到了人類的3倍，可以在短期內觀察骨折愈合時骨組織的變化［15］。③兔應用廣泛，可以用合理的時間、工作和成本得到更有價值的數據；造模操作簡便，成功率高，可以減少實驗時間，降低外來影響因素對動物模型的影響［2］。因此選擇兔的上肢橈骨制作骨折模型，研究低頻電磁場和低強度超聲波治療在單獨和聯合作用情況下對人類骨傷研究與治療，骨折的再生與修復，是一種較為理想的方法。

動物模型是否科學合理，是否適用于人類疾病的模擬治療，需要從多方面進行評估。第一，動物模型的建立是否符合臨床診斷與治療的實際要求。因為建立動物模型的目的是用于對人類疾病的認識、探索與研究，只有最大程度的滿足于臨床的實際需要，才能使實驗的結果具有最大程度的科學性和可信度。如果動物模型與相關的人類疾病出現較大的差異，那么模型就失去了意義。兔橈骨骨折模型雖然可以很好的模擬人類橈骨骨折時的病理狀態，但畢竟動物不同于人類，兩者在解剖學和生物學等方面有一定程度的差異，而且骨折的修復與再生是一個涉及全局性的過程，所以即使在動物模型上取得較好的實驗結果，也需要在臨床上進行驗證和評估［15－18］；第二，建立動物模型的方法必須具有穩定性和可重復性。開展動物實驗需要嚴格遵守重復的原則，才能使實驗結果真實有效。因此需要的動物模型都必須具有相同的穩定的疾病模擬狀態；第三，建立動物模型的方法要有較強的易操作性。實驗過程中需要大量的樣本，動物模型需要重復建造，如果造模難度過大，則會造成較大的工作量，也延長了每批次實驗間隔的時間，增加了諸多不穩定因素，可控性降低。

骨折動物模型在研究人類骨折中起到非常重要的作用，采用合適的動物模型可以對疾病研究起到事半功倍的效果［19］。一方面，出現骨折有較大的隨機性，而在臨床診斷和治療過程中還會不斷面臨新的問題，因此需要對臨床實踐問題進行歸納和總結，以期建立符合實踐要求的動物模型；另一方面，對已經建立的動物模型，既可以在此基礎上進行多方位深層次的研究，也可以根據新情況不斷完善與改良。

［1］張保中.低強度超聲波在骨折愈合中的作用 ［J］.中國骨與關節外科，2008，1（1）：67－71.

［2］趙震宇，邵林，劉建宇，等.外固定方法制作的大鼠股骨骨折模型 ［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2011，15（24）：4387－4390.

［3］徐自勝，李孝林，任伯緒.兔脛骨骨折模型的不同固定方法 ［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2011，15（33）：6103－6106.

［4］張敦偉，李守軍，曾憲斌，等.犬股骨遠端髁間T型骨折內固定實驗模型的建立 ［J］.動物醫學進展，2010，31（3）：76－78.

［5］Wilke HJ，Krischak S，Claes L.Biomechanical comparison of calf and human spines ［J］.J Orthop Res，1996，14（3）：500－503.

［6］王維彬，韓大成，陳建海，等.兔脛骨平臺骨折愈合的生物力學變化規律 ［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2010，14（39）：7277－7280.

［7］張連方，齊進，王晉申，等.小鼠閉合性股骨骨折模型的建立與評估 ［J］.中國矯形外科雜志，2010，18（2）：143－146.

［8］Yingling VR，Callaghan JP，McGill SM.The porcine cervical spine as a model of the human lumbar spine：an anatomical，geometric，and functional comparison ［J］.J Spinal Disord，1999，12（5）：415－423.

［9］張萬強，楊麗平，宋慶慧，等.外用白脈軟膏對家兔橈骨骨折模型愈合過程及骨痂組織結構的影響 ［J］.中國中醫基礎醫學雜志，2012，18（2）：170－172.

［10］蔡羽中，何愛詠，王欣文，等.辛伐他汀與BMP－2促進兔橈骨骨折愈合的對比觀察研究 ［J］.生物醫學工程與臨床，2011，15（1）：10－14.

［11］楊成芳，張均智，梁榮感.白花丹對家兔骨折愈合的影響 ［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2009，13（2）：296－299.

［12］中華人民共和國科學技術部.關于善待實驗動物的指導性意見 ［Z］.2006－09－30.

［13］陳希聰，陳志維，黎惠萍，等.骨寶丸對兔橈骨骨折愈合影響的實驗研究 ［J］.中國醫藥指南，2012，10（12）：91－94.

［14］袁兵，卞俊，任銳，等.家兔脛骨骨折模型的建立 ［J］.海軍醫學雜志，2012，33（4）：222－223.

［15］湯譯博，趙亮，蘇佳燦.骨折動物模型的研究進展 ［J］.中國骨傷，2011，24（1）：91－93.

［16］O＇Loughlin PF，Morr S，Bogunovic L，et al.Selection and development of preclinical models in fracture－healing research ［J］.J BoneJoint Surg Am，2008，90（Suppl 1）：79－84.

［17］Holstein JH，Matthys R，Histing T，et al.Development of a stable closed femoral fracture model in mice ［J］.J Surg Res，2009，153（1）：71－75.

［18］Shirley D，Marsh D，Jordan G，et al.Systemic recruitment of osteoblastic cells in fracture healing ［J］.J Orthop Res，2005，23：1013－1021.

［19］Zachos TA，Bertone AL，Wassenaar PA，et al.Rodent models for the study of articular fracture healing ［J］.J Invest Surg，2007，20（2）：87－95.