檢測汞的全細胞生物傳感器構建

楊鋒+齊顯尼+王欽宏+張雪洪

摘 要：汞（Hg）是環境中主要的重金屬污染物，暴露于環境中的汞對人體健康有嚴重危害。汞的精確檢測對控制環境污染和減少對健康的危害有著重要意義。該實驗是基于MerR蛋白調節的啟動子對應答汞毒性基因的調控機理，首先通過試驗確定紅色熒光蛋白mCherry為報告基因。將MerR基因片段鏈接到質粒pUC57得到質粒pUC57-MerR，以其為模版得到質粒pUCRR，轉入到E. coli DH5α中，得到工程菌株E. coli UCRR。為提高菌株的性能和靈敏度，通過易錯PCR技術獲得MerR基因突變體庫，篩選出菌株V109E在培養4 h時，熒光信號強度遠遠高于其他菌株熒光信號，對Hg2+有高度專一性，檢測Hg2+的最低濃度為0.5nM。

關鍵詞：汞檢測 全細胞生物傳感器 MerR蛋白 易錯PCR

中圖分類號：R3 文獻標識碼：A 文章編號：1674-098X（2014）08（c）-0205-05

The Construction of Whole-Cell Biosensors for Monitoring Mercury

Abstract：Mercury has been well known as an environmental pollutant for several decades. Emissions of mercury to the environment could have serious effects on human health. To control mercury pollution and reduce mercury damage to human health， sensitive determination of mercury is important. Our biosensor design for mercury detection was based on MerR whice is an activator that controls genes involved in the response to mercury poisoning. we selected mCheery out for fluorescent detection signal ，Then cloned MerR into pUC57 to obtain pUC57-MerR， and utilized pUC57-MerR as a template to obtain the recombinant plasmid pUCRR. This plasmid was transformed into E. coli DH5α in order to obtain engineered strain E. coli UCRR. We established a library of mutated MerR gene by Error-prone PCR in order to improve MerR protein derived biosensors to detect and monitor mercury more efficiently and with higher sensitivity. The mutant MerR genes V109E which have improved functionalities been selected. V109E had highest sensitivity increasing than other mutated mercury biosensors after 4-hour incubation time.The whole-cell biosensors based on V109E had high sensitivity and Specificity， the lowest concentration of mercury detection had reached to 0.5nM.

Key words： Mercury detection Whole-cell biosensors MerR protein Error-prone PCR

1 前言

汞（Hg）是自然界唯一以液態形式存在的金屬，0℃時汞即可揮發為汞蒸汽，并可隨大氣循環長距離跨界污染，是除溫室氣體外對全球環境造成嚴重影響的化學物質之一，國際環境規劃署已將其列為全球性污染物[1]。

準確檢測和監控環境中，特別是水域中的汞對于人們的日常生產和生活有著重要意義?，F有各種檢測汞的常規技術手段及裝置，如原子吸收光譜法、原子發射光譜法、原子力學光譜法和電感耦合等離子體質譜法，具有很好的靈敏性，但是這些檢測手段和裝置的使用具有極大的局限性，即設備價格昂貴，都需要將待測樣品轉化為汞原子，同時需要培訓專業人員來操作[2]。更為重要的是這些檢測方法都不能測定汞污染的生物可利用濃度（Bioavailable concentration）?；诖嗽?，近年來開發生物傳感器檢測汞及其他金屬污染物越來越受到人們的高度重視。

生物傳感器是一種分析檢測裝置，通常由一個固定化的生物材料緊密地與一個與之兼容的傳感器所組成，能把生物信號轉換為易于量化的電信號。生物傳感器在對環境污染物進行監測時，有體積小、簡便、快速、靈敏度高、重現性好等優點，還可原位在線分析。

MerR家族轉錄激活子的原型來自于革蘭氏陰性細菌汞抗性（mer）操縱子中的調節因子，通常在轉座子Tn21和Tn501中存在[3]。各種熒光蛋白（如emGFP，eYFP，eBFP或mCherry）可以作為易于檢測的報告基因，可以與MerR或MerR類蛋白調節的啟動子相融合，構建后的重組細菌與汞離子接觸后能夠產生可以定量檢測的熒光信號[4]（圖1）。endprint

準備高質量的遺傳改造生物傳感器用于檢測重金屬的關鍵因素是依賴金屬結合蛋白的專一性和親和性。應用蛋白質定向進化和高通量篩選技術，通過MerR的定向進化和篩選，可以得到一些性能改變的MerR突變體[5-7]。在汞離子存在時，這些突變蛋白的產生能快速增加熒光蛋白基因的表達。

該實驗旨在利用金屬調節蛋白MerR和紅色熒光蛋白mCherry，結合合成生物學和蛋白質定向進化技術，構建新一代高靈敏、專一性的檢測汞的全細胞生物傳感器。

2 構建檢測汞的全細胞傳感器

2.1 材料與方法

2.1.1 材料

2.1.1.1 菌種和質粒

本試驗所用菌株和質粒如表1。

2.1.1.2 培養基

LB培養基，LB固體培養基，5×M9鹽溶液，M9基本培養基，M9CA培養基， M9CAG培養基。

2.1.1.3 實驗儀器及設備

酶標儀（美國Molecular Devices）；渦旋混勻器（美國精騏）；恒溫振蕩器（美國精騏）；恒溫培養箱（上海志成）；立式超低溫保存箱（中國青島海爾）；可見光凝膠投射儀（北京百泰克公司）；電泳儀（美國BioRad）；PCR儀（美國BioRad）；96孔普通酶標板、2 mL96孔深孔板（Thermo fisher scientific） 。

2.1.2 實驗方法

MerR基因序列PCR擴增，PCR產物的電泳檢測，MerR基因擴增片段的回收；感受態制備E.coli DH5α，目的片段與pUC19載體相連，化學法轉化，挑取陽性克隆進行驗證；生物傳感器測定Hg2+含量。采用易錯PCR方法對MerR基因進行定向進化，構建文庫，并結合mCherry基因，通過熒光信號強弱和顏色反應篩選最佳生物傳感器。

2.2 結果與討論

2.2.1 最佳熒光蛋白信號的選擇

本實驗選取四種熒光蛋白，即紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、藍色熒光蛋白。四種熒光蛋白基因鏈接到pUC19質粒中，得到質粒pUC19R、pUC19G、pUC19Y、pUC19B，再轉入到E.coli DH5α感受態細胞中。將獲得的單克隆接種到LB、M9CA和M9CA+0.4%Glucose培養基中，測得熒光信號。從圖2中可以看出，綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白和藍色熒光蛋白的熒光信號背景值較大，紅色熒光蛋白mCherry的背景值最小。因此本實驗選取mChreey蛋白用于以后實驗。

2.2.2 生物傳感器的構建

本試驗所用基因MerR由華大基因合成，全長720bp，包括MerR編碼基因序列、MerR和MerT的啟動子以及MerT基因，并將片段鏈接到質粒pUC57得到質粒pUC57-MerR，以質粒pUC57-MerR為模版，利用高保證酶TransStartTM FastPfu DNA聚合酶進行MerR基因PCR擴增。利用SphI和NotI雙酶切將pUC19R質粒的T7啟動子用MerR基因替換，得到質粒pUCRR，將質粒轉入到E. coli DH5α中，得到工程菌株E. coli UCRR（圖3）。

2.2.3 MerR基因突變文庫構建

利用epPCR得到含有突變位點的MerR基因之后轉入到pUC19R，之后利用含有Hg2+的LB培養基進行篩選，得到熒光信號強度較高的菌株，如圖4所示。

2.2.4 突變文庫的篩選

從圖5中可以看出，單菌株呈現不同程度的紅色，這是由于通過epPCR得到的突變MerR基因，某些氨基酸發生改變，導致重組菌株對Hg2+檢測的靈敏度發生變化，顏色越深表示對Hg2+ 的靈敏度越高。挑選顏色較深的菌株進行進一步篩選，得到最佳菌株。

基于顏色反應平板篩選和液體培養篩選，5000個突變體中篩選出22個突變菌株。得到的22株菌對Hg2+有較高的靈敏度。通過測序得知22菌株中，MerR基因均有氨基酸發生改變。如圖6所示，發生變化的氨基酸標注在MerR蛋白序列中，其中黑色部分是DNA結合區域（1～29），有2個位點的氨基酸發生改變，15位的賴氨酸變成谷氨酸，16位的丙氨酸變成纈氨酸；藍色部分為偶聯結合區域（30～81），連著DNA結合區域和Hg2+結合區域，這個區域有7個位點發生氨基酸改變，其中72位和77位突變氨基酸相同，都是谷氨酸變成賴氨酸，在74位置，有2菌株都發生改變，有亮氨酸分別變成了谷氨酰胺和纈氨酸，；綠色部分為Hg2+結合區域（82～117），這個區域7個氨基酸發生改變，在99位點出，有3菌株發生氨基酸改變，均有賴氨酸分別變成天冬氨酸、谷氨酰胺和蘇氨酸，109位點有2菌株都發生改變，纈氨酸分別變成谷氨酸和蛋氨酸；在Hg2+結合區域下游部分同樣有5個位點發生氨基酸改變。

將22菌株接種到M9、M9CA、M9CAG和LB培養基中，測定紅色熒光信號。從圖7中可以看出，與原始菌株相比，22菌株的熒光信號均高于原始菌株。其中16、66、80、86位點以及125位點（絲氨酸變成蘇氨酸）發生氨基酸突變的菌株的熒光信號較弱，說明氨基酸改變沒有使得菌株對Hg2+的靈敏度增加；與原始菌株相比，15、56位點氨基酸的改變使得菌株的熒光信號顯著增強；74位點有2菌株的MerR基因發生改變，其中亮氨酸變成谷氨酰胺的改變使得菌株熒光信號增強的幅度較大；99位點處有3菌株的MerR基因發生突變，其中變成天冬氨酸和谷氨酰胺的菌株熒光信號增強的幅度較大；109位點有2菌株的MerR基因發生改變，與所有突變菌株相比，纈氨酸變成谷氨酸菌株的熒光信號增強程度最大；124和125位點均有2菌株的MerR基因發生改變，其中纈氨酸變成天冬氨酸，絲氨酸變成脯氨酸菌株的熒光信號增強幅度較大。

從圖7中還可以看出，同一突變體菌株在不同培養基中培養，其熒光信號同樣存在差異，其中M9培養基培養菌株測得的熒光信號較弱，LB培養基培養菌株測得的熒光信號較強。endprint

2.2.5 突變菌株對Hg2+專一性評價

從篩選的22突變菌株挑選7菌株，分別記作K15E、F56L、L74Q、V109E、V124D、S125P和K99N。將選取7株菌和原始菌株在LB培養之后，分別加入濃度為1000nM的金屬離子溶液，分別是MnCl2、ZnCl2、FeCl3、CuCl2、NiCl2、CoCl2、MoCl2、CrCl3、CdCl2、PbCl2和HgCl2。從圖8可以看出，原始菌株和7株MerR突變菌株僅在有HgCl2存在情況下產生熒光信號，說明菌株原始MerR基因和發生突變的MerR基因對Hg2+有較高的專一性。

2.2.6 突變菌株對Hg2+反應時間評價

利用菌株檢測Hg2+含量，誘導時間不同能夠影響檢測結果的準確性。從圖9可以看出，在不同反應時間內，產生的熒光信號強弱不同。在2 h時，菌株K15E的熒光信號最強，菌株K99S的熒光信號最弱，說明菌株K15E能夠在最短時間內對Hg2+檢測；4 h時，菌株V109E的熒光信號強度遠遠高于其他菌株，其次是S125P，菌株K99S的熒光信號依然最弱，說明隨著時間進行，菌株V109E熒光信號增強最大。說明檢測Hg2+含量時，反應時間為4 h為最佳，此時菌株產生的熒光信號將強，易于減小檢測的誤差，保證檢測結果準確性。

2.2.7 突變菌株對Hg2+濃度評價

從圖10可以看出，在Hg2+濃度為0.5nM和1.0nM時，原始菌株沒有產生熒光信號，說明原始菌株不能檢測低濃度的Hg2+（1.0nM以下）。MerR基因突變菌株在0.5nM和1.0nM時，均能夠產生顯著的熒光信號，其中菌株V109E熒光信號最強，其次是S125P，菌株K99N的熒光信號最弱。說明突變菌株能夠檢測Hg2+的最低濃度為0.5nM，具有較低的檢測限對于Hg2+檢測的準確性有很大意義。

3 結語

該試驗選取紅色熒光蛋白mCherry為報告基因。將MerR基因與mCherry基因鏈接形成的基本構造生物傳感器。通過易錯PCR技術構建突變文庫，從 5000個突變體中22個MerR基因突變菌株對Hg2+具有較高的專一性；其中菌株V109E熒光信號增強最大，且Hg2+的最低檢出限可達0.5nM。通過突變菌株的Hg2+反應時間評價試驗中，4 h時，菌株V109E的熒光信號強度遠遠高于其他菌株。說明檢測Hg2+含量時，反應時間為4 h為最佳，最終獲得了性能最佳的全細胞生物傳感器。

參考文獻

[1] 覃東立，姜秋俚，付友生.全球汞污染回顧與分析[J].環境保護科學，2009，35（4）：75-78.

[2] Knecht MR，Sethi M. Bio-inspired colorimetric detection of Hg2+ and Pb2+ heavy metal ions using Au nanoparticles[J].Anal Bioanal Chem，2009，394（1）：33-46.

[3] Nigel LB，Simon JF，Pridmore RD，et al. Nucleotide Sequence of a Gene from the Pseudomonas Transposon Tn501 Encoding Mercuric Reductaset[J].Biochemistry，1983（22）：4089-4095.

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[5] Ivask A，Green T，Polyak B. et al. Fibre-optic bacterial biosensors and their application for the analysis of bioavailable Hg and as in soils and sediments from aznalcollar mining area in Spain[J].Biosensors and Bioelectronics，2007，22（7）：1396-1402.

[6] Selifonova O，Burlage R. Bioluminescent sensors for detection of bioavailable Hg（II） in the environment[J].Applied and environmental microbiology，1993，59（9）：3083-3090.

[7] Petanen T，Romantschuk M.Use of bioluminescent bacterial sensors as an alternative method for measuring heavy metals in soil extracts[J].Analytica Chimica Acta，2002，456（1）：55-61.endprint

2.2.5 突變菌株對Hg2+專一性評價

從篩選的22突變菌株挑選7菌株，分別記作K15E、F56L、L74Q、V109E、V124D、S125P和K99N。將選取7株菌和原始菌株在LB培養之后，分別加入濃度為1000nM的金屬離子溶液，分別是MnCl2、ZnCl2、FeCl3、CuCl2、NiCl2、CoCl2、MoCl2、CrCl3、CdCl2、PbCl2和HgCl2。從圖8可以看出，原始菌株和7株MerR突變菌株僅在有HgCl2存在情況下產生熒光信號，說明菌株原始MerR基因和發生突變的MerR基因對Hg2+有較高的專一性。

2.2.6 突變菌株對Hg2+反應時間評價

利用菌株檢測Hg2+含量，誘導時間不同能夠影響檢測結果的準確性。從圖9可以看出，在不同反應時間內，產生的熒光信號強弱不同。在2 h時，菌株K15E的熒光信號最強，菌株K99S的熒光信號最弱，說明菌株K15E能夠在最短時間內對Hg2+檢測；4 h時，菌株V109E的熒光信號強度遠遠高于其他菌株，其次是S125P，菌株K99S的熒光信號依然最弱，說明隨著時間進行，菌株V109E熒光信號增強最大。說明檢測Hg2+含量時，反應時間為4 h為最佳，此時菌株產生的熒光信號將強，易于減小檢測的誤差，保證檢測結果準確性。

2.2.7 突變菌株對Hg2+濃度評價

從圖10可以看出，在Hg2+濃度為0.5nM和1.0nM時，原始菌株沒有產生熒光信號，說明原始菌株不能檢測低濃度的Hg2+（1.0nM以下）。MerR基因突變菌株在0.5nM和1.0nM時，均能夠產生顯著的熒光信號，其中菌株V109E熒光信號最強，其次是S125P，菌株K99N的熒光信號最弱。說明突變菌株能夠檢測Hg2+的最低濃度為0.5nM，具有較低的檢測限對于Hg2+檢測的準確性有很大意義。

3 結語

該試驗選取紅色熒光蛋白mCherry為報告基因。將MerR基因與mCherry基因鏈接形成的基本構造生物傳感器。通過易錯PCR技術構建突變文庫，從 5000個突變體中22個MerR基因突變菌株對Hg2+具有較高的專一性；其中菌株V109E熒光信號增強最大，且Hg2+的最低檢出限可達0.5nM。通過突變菌株的Hg2+反應時間評價試驗中，4 h時，菌株V109E的熒光信號強度遠遠高于其他菌株。說明檢測Hg2+含量時，反應時間為4 h為最佳，最終獲得了性能最佳的全細胞生物傳感器。

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2.2.5 突變菌株對Hg2+專一性評價

從篩選的22突變菌株挑選7菌株，分別記作K15E、F56L、L74Q、V109E、V124D、S125P和K99N。將選取7株菌和原始菌株在LB培養之后，分別加入濃度為1000nM的金屬離子溶液，分別是MnCl2、ZnCl2、FeCl3、CuCl2、NiCl2、CoCl2、MoCl2、CrCl3、CdCl2、PbCl2和HgCl2。從圖8可以看出，原始菌株和7株MerR突變菌株僅在有HgCl2存在情況下產生熒光信號，說明菌株原始MerR基因和發生突變的MerR基因對Hg2+有較高的專一性。

2.2.6 突變菌株對Hg2+反應時間評價

利用菌株檢測Hg2+含量，誘導時間不同能夠影響檢測結果的準確性。從圖9可以看出，在不同反應時間內，產生的熒光信號強弱不同。在2 h時，菌株K15E的熒光信號最強，菌株K99S的熒光信號最弱，說明菌株K15E能夠在最短時間內對Hg2+檢測；4 h時，菌株V109E的熒光信號強度遠遠高于其他菌株，其次是S125P，菌株K99S的熒光信號依然最弱，說明隨著時間進行，菌株V109E熒光信號增強最大。說明檢測Hg2+含量時，反應時間為4 h為最佳，此時菌株產生的熒光信號將強，易于減小檢測的誤差，保證檢測結果準確性。

2.2.7 突變菌株對Hg2+濃度評價

從圖10可以看出，在Hg2+濃度為0.5nM和1.0nM時，原始菌株沒有產生熒光信號，說明原始菌株不能檢測低濃度的Hg2+（1.0nM以下）。MerR基因突變菌株在0.5nM和1.0nM時，均能夠產生顯著的熒光信號，其中菌株V109E熒光信號最強，其次是S125P，菌株K99N的熒光信號最弱。說明突變菌株能夠檢測Hg2+的最低濃度為0.5nM，具有較低的檢測限對于Hg2+檢測的準確性有很大意義。

3 結語

該試驗選取紅色熒光蛋白mCherry為報告基因。將MerR基因與mCherry基因鏈接形成的基本構造生物傳感器。通過易錯PCR技術構建突變文庫，從 5000個突變體中22個MerR基因突變菌株對Hg2+具有較高的專一性；其中菌株V109E熒光信號增強最大，且Hg2+的最低檢出限可達0.5nM。通過突變菌株的Hg2+反應時間評價試驗中，4 h時，菌株V109E的熒光信號強度遠遠高于其他菌株。說明檢測Hg2+含量時，反應時間為4 h為最佳，最終獲得了性能最佳的全細胞生物傳感器。

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[7] Petanen T，Romantschuk M.Use of bioluminescent bacterial sensors as an alternative method for measuring heavy metals in soil extracts[J].Analytica Chimica Acta，2002，456（1）：55-61.endprint