液質聯用快速測定河鲀魚肝臟中河鲀毒素含量的方法研究*

曹文卿，林黎明，時 迪，楊桂朋**

（1.中國海洋大學化學化工學院，山東 青島 266100；2.山東出入境檢驗檢疫技術中心，山東 青島 266002）

河鲀魚不僅味極鮮美，亦是一味珍貴中藥；能補虛、去濕、理腰腳、去痔、殺蟲；去疳、消腫，宋《開寶本草》、明《本草蒙筌》皆有記載。其藥用價值源自其含有的微量劇毒河鲀毒素（Tetrodotoxin，TTX），是毒性極大的一種小分子海洋毒素，LD50為8.7μg/kg，為氰化鈉的1 000倍。毒性作用主要表現為阻遏神經和肌肉的鈉離子傳導，致死率高達60%［1］。野生河鲀魚幾乎普遍含毒，養殖品種則因食源不同低毒或無毒，肝臟是其毒性大小的標志性器官。在嚴格控制TTX劑量的前提下，含毒河鲀魚肝臟可用作鎮痛、戒毒的藥材；除毒后的河鲀肝油亦可作為提高人體免疫力的保健食品；適量為良藥，過量則奪命。因此從食品安全和毒性控制方面考慮，快速準確測定河鲀魚肝臟中TTX含量具有重要意義。而TTX微溶于水，可溶于弱酸水溶液；溶液酸度對其穩定性影響大，pH值＞7和pH值＜3時均易分解；220℃以上炭化［2－3］。目前 TTX的測定方法主要有生物檢測法（小鼠法）、酶聯免疫［4－5］、電化學法（毛細管電泳法）、色譜法（包括液相色譜、液質聯用、氣質聯用）等［6－9］。但酶聯免疫法成本高，小鼠法因小鼠個體差異影響測定值的準確性；液相色譜－熒光檢測以及氣相－質譜方法需將TTX堿解衍生，步驟復雜、耗時，源自樣品的熒光物質干擾也影響檢測結果。而液質聯用方法，樣品前處理凈化要求高，多采用乙酸水、三氯乙酸等溶液提取，樣品凈化需經過固相萃?。ㄈ鏑18小柱、離子交換柱、石墨化炭黑小柱等）［9－12］和超濾等手段［13－14］，成本高且耗時，最終所得提取液仍存在嚴重基質效應；為增強TTX在色譜柱上的保留在流動相中加入七氟丁酸［15］；劉希等建立了液相色譜－飛行時間質譜方法，陽離子交換－反相混合色譜柱測定人血漿中河鲀毒素，但檢測限較高（250μg/L），僅能用于測定河鲀魚樣品中mg/L水平的河鲀毒素［16］。本文建立一種快速測定河鲀魚肝臟樣品中河鲀毒素的高效液相色譜串聯質譜方法，采用酸解超聲提取，采用正己烷脫脂和QuEChERS［17］（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged and Safe）方法配制合適吸附劑凈化樣液，離心過濾后直接進樣分析（節省濃縮時間），流動相不使用離子對試劑，前處理過程簡捷、節約。定性定量準確，方便實用，適用于河鲀魚肝臟中河鲀毒素的快速檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），6410MS/MS質譜檢測器（Agilent公司），配有電噴霧離子源（ESI）；電子分析天平（XS 205，0.1mg，瑞士Mettoler toledo公司）；高速冷凍離心機（CR22GⅢ，日本日立公司）；渦旋混勻器（IKA3，德國IKA公司）；均質器（IKA T25）；組織粉碎機；KQ-500DB超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

河鲀毒素標準品（純度≥98%，百靈威科技公司）；乙酸、乙酸銨（≥99%，Fluka公司），乙腈、甲醇、正己烷（色譜純，德國Merk公司），石墨化碳黑（Cleanert pesticarb，120～400目）、丙基乙二胺吸附劑（PSA）和十八烷基鍵合硅膠（C18，40μm）吸附劑（天津博納艾杰爾公司），0.22μm聚四氟乙烯－尼龍復合濾膜（Waters公司）；實驗用水為Milli-Q處理水（美國Millipore公司）。

精確稱取河鲀毒素標準品用純水溶解并定容，配制成濃度為100mg/L的標準儲備液（－20℃保存）。儲備液進一步用純水稀釋成10mg/L的中間溶液。提取液：1%乙酸甲醇（1∶99，V/V）溶液（pH＝3.8）。

1.2 樣品預處理

（a）鮮河鲀魚冷凍處死，小心取其肝臟部分，經均質制樣機充分粉碎；陰性樣品于2012年3月取自威海人工養殖紅鰭東方鲀；陽性肝臟來自2012年5月青島沙子口漁碼頭收購的野生暗紋東方鲀。

（b）準確稱取上述試樣（1.00±0.01）g于50mL聚丙烯離心管中，準確加入5mL 1%乙酸甲醇，均質30s后于50℃下超聲提取30min。8 000r/min離心5min，將上清液轉移至另一潔凈聚丙烯離心管中；殘渣加入4mL 1%乙酸甲醇，重復提取1次，合并上清液，將合并后的上清液4℃下12 000r/min離心5min，取1.5 mL加入5mL正己烷，劇烈渦旋混勻30s后4℃12 000r/min離心5min，棄正己烷層，重復脫脂1次，所得清液待凈化。

（c）取上步上清液1.0mL于2mL EP（Eppendorf）管中，加入100mg C18粉和100mg石墨化碳黑（GCB）粉末劇烈渦旋混合30s，10 000r/min離心5min，上層清液過0.22μm聚PTFE－尼龍復合濾膜，收集于棕色進樣小瓶中待測。

1.3 色譜－質譜條件

河鲀毒素的分子式為C11H17O8N3，相對分子質量為319.27，是一種氨基過氫喹唑啉化合物，其結構呈籠狀如圖1所示，包括1個碳環、1個胍基、6個羥基和1個半縮醛內酯官能團，因而其極性較強，在酸性條件下易發生質子化，在正離子模式下（［M＋H］＋）靈敏度遠高于負離子模式（［M－H］－），故選擇ESI源和酸性流動相，氨基色譜柱正離子模式下多反應監測模式檢測。

圖1 河鲀毒素的分子結構Fig.1 Structure of tetrodotoxin

1.3.1 色譜條件 TSK-gel Amide-80色譜柱（3μm，150mm×2.0mm（i.d.））；流動相 A：乙腈；流動相B：水（0.15% 乙 酸，V/V，含 10mmol/L 乙 酸 銨，pH＝4.4）。流速及洗脫梯度見表1（柱平衡時間5min）；進樣量：5μL；柱溫：35℃。

表1 流動相洗脫梯度Table 1 The gradient elution procedures of tetrodotoxin

1.3.2 質譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI＋）；掃描方式：正離子掃描；檢測模式：多反應監測（MRM）；毛細管電壓：正3 500V；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流量：10L/mL；霧化器壓力：45psi；TTX的質譜定性定量信息見表2，液相轉向閥時間分割參數等見表3。

表2 河鲀毒素的HPLC-MS/MS多反應監測參數Table 2 The HPLC-MS/MS parameters of tetrodotoxin in multiple reaction monitoring（MRM）

表3 TTX的液相轉向閥分割參數Table 3 The time segments of diversion valve of HPLC for tetrodotoxin

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

分別選用甲醇∶乙腈（v/v＝1∶1）-0.1%甲酸水溶液、甲醇-5mmol/L的乙酸銨水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.15%的乙酸水溶液（含10mmol/L乙酸銨）乙腈-0.1%的甲酸水溶液（含10mmol/L的乙酸銨）為流動相。并進行梯度洗脫。結果表明，在該儀器條件下，以乙腈-0.1%的甲酸水溶液（含10mmol/L的乙酸銨）和乙腈-0.15%的乙酸水溶液（含10mmol/L乙酸銨）時，采用2.3.1（見表1）的梯度程序，TTX與雜質均能得到較好分離，且保留時間適宜（11.6min附近），待測樣品中化合物色譜峰的保留時間與標準溶液相比變化范圍在±0.25min之內），各基質總離子流圖（見圖2）與陽性河鲀魚肝臟樣品提取液質譜圖中無明顯干擾峰（見圖3）。差異在于，用乙酸銨作緩沖鹽時比用甲酸銨峰形好，且濃度增大利于TTX峰形尖銳，但高濃度的乙酸銨會使質譜靈敏度下降，影響儀器耐用性，綜合考慮，選用乙腈-0.15%的乙酸水溶液（含10 mmol/L乙酸銨）作為流動相。

圖2 TTX標準品的總離子流圖與提取離子流圖Fig.2 MS spectrum TIC and EIC of tetrodotoxin

2.2 質譜條件的優化

從質譜全掃描得到TTX的一級質譜圖，分子離子為320.2；以分子離子為母離子進行子離子掃描，得到相應子離子：302.2、162.1、284.0；選取最強的2個子離子302.2、162.1，并將豐度最高的離子對 320.2/302.2用以定量。優化碎裂電壓（Fragmentor）和碰撞能（CE）（優化的參數見表2）。

圖3 TTX陽性河鲀魚肝臟樣品（TTX含量1 165.7μg/kg）中TTX總離子流圖及提取離子流圖Fig.3 TIC ＆ EIC of MS Spectrum of tetrodotoxin in wild fugu liver sample（TTX 1 165.7μg/kg）

2.3 提取與凈化方法的改進

2.3.1 提取液的選擇 分別以9mL 5種不同提取液（a：提取液1%乙酸乙腈－甲醇1.0%acetic acid acetonitrile methonal（1∶75∶24，V/V）；b：提取液0.2%乙酸乙醇0.2%acetic acid methonal（1∶499，V/V）；c：提取液1%乙酸乙醇1.0%acetic acid methonal（1：99，V/V）；d：提取液1.5%乙酸乙醇1.5%acetic acid methonal（1.5∶98.5，V/V）；e：提取液2.0%乙酸乙醇2.0%acetic acid methonal（1∶49，V/V））對河鲀魚肝臟樣品（1.00g）進行提取，得到TTX的加標回收率（見圖4）。由圖4（A）可見，提取液c對河鲀魚肝臟中河鲀毒素的加標回收率最高（95.2%）；提取液d，e稍次之，提取液b回收率為71%；提取液a最低，不到55%.表明：（1）乙酸甲醇對TTX的提取能力優于乙酸乙腈甲醇溶液；（2）乙酸甲醇溶液中乙酸濃度影響對目標物的提取效率（低于1%時，提取能力太低；而高于1%時提取能力不隨酸度增大而增強），因此本實驗采用c溶液作為TTX提取溶劑。同時考察在50℃下超聲時間對提取效果的影響（見圖4（B）），提取時間從10～25min之間變化時，TTX回收率隨超聲時間增加而增大，但時間超過30min以后回收率趨于穩定；鑒于河鲀毒素的熱不穩定性，因而將實驗條件定為50℃超聲25min，避免提取過程中TTX發生降解。

2.3.2 吸附劑的選擇 本實驗分別選擇（1）N-丙基乙二胺吸附劑（PSA）；（2）GCB；（3）GCB和PSA；（4）農殘吸附劑fatty；（5）農殘吸附劑pigment；（6）中性氧化鋁吸附劑（Al2O3－N）；（7）C18＋GCB；（8）C18＋PSA；（9）C18＋PSA＋GCB；（10）硅藻土（Diatomite）；（11）C18；（12）硅鎂型吸附劑（Florisil，60～100目）；（13）C18＋Diatomite；和（14）GCB＋Diatomite作為分散固相萃取吸附劑，在2.3.1提取溶劑c中添加TTX標準，比較了不同吸附劑及其組合在提取溶劑c環境中對TTX回收效果的影響（見圖6A）。

圖4 不同類型提取液（A）和超聲提取時間（B）對TTX回收率的影響Fig.4 Effects of different types of exacted solutions（A）＆times of ultrasonic extraxtion（B）on recoveries of tetrodotoxin

圖5 3種典型提取溶劑提取河鲀魚肝臟樣品中TTX總離子流圖Fig.5 TIC of 3types of exacted solutions for tetrodotoxin in fugu liver samples

從圖6（A）可見，C18、GCB以及二者混合物作為QuEChERS吸附劑時，TTX回收率在84%以上，單用硅藻土、硅藻土與C18、硅藻土與GCB的混合物時回收率則分別為60%、79%和68%；硅鎂型材料、農殘除脂和脫色素材料分別得到27%和23%；而PSA的組合以及中性氧化鋁作吸附劑TTX回收率均低于5%；原因在于GCB表面碳原子間均為具有單電子對和活潑離子的SP2雜化，其六邊形微觀結構，對平面分子及含平面芳香環的分子具有強吸附作用，能去除具有共軛結構的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和組氨酸等雜質；GCB表面總體憎水，可吸附非極性與弱極性化合物；次表面存在的極性位點使之能夠吸附極性化合物或作為離子交換劑［18－23］，因此表現為可同時吸附非極性、弱極性以及極性化合物的廣譜吸附性能；在本實驗采用的提取環境中可吸附河鲀魚風味成分精氨酸、谷氨酸、天門冬酸等；C18也是一種廣譜性非極性凈化劑，能夠針對非極性雜質進行有效提取；而硅藻土吸附雜質是篩分、深層過濾、分子間力、Zeta電位和離子交換作用的結果；PSA為弱陰離子交換劑，分子結構含有2個氨基，可形成氫鍵或離子交換與有機酸及脂肪酸、糖類等結合，也能吸附TTX，因而回收率較低［24］?？紤]到河鲀魚肝臟提取液含有豐富的極性和非極性的風味成分不飽和脂肪酸、微蛋白類等化學成分［25］，據圖6A實驗結果知C18，GCB為可選凈化吸附劑，于是在加標河鲀魚肝臟提取液中進一步考察凈化劑（a）：C18；（b）：GCB；（c）：C18＋GCB對實際樣品基質雜質的吸附效果；得到結果見圖6（B），從圖6（B）知，C18和GCB對吸附河鲀魚肝臟基質提取液中的雜質具有協同作用。綜合考慮，本方法采用C18和GCB作為QuEChERS凈化劑。本實驗還考察了GCB用量對TTX回收率的影響（見圖6（C）），C18用量為100mg，GCB用量分別為30，50，100 mg時，TTX的回收率差別不大（相對標準偏差為0.9%），當GCB用量從100mg增大到150mg時，質譜圖信噪比（S/N）明顯增強（從53.7增大到79.7）；但TTX回收率卻下降3.4%。

圖6 不同吸附劑（A、B）和不同GCB用量對TTX回收率的影響（C）Fig.6 Effects of different dispersive sobents（A）and different amounts of GCB（B）on the recoveries of tetrodotoxin

2.4 方法的線性范圍

準確稱取試樣（1.00±0.01）g于50mL聚丙烯離心管中，準確加入河鲀毒素標準溶液適量，使添加水平分別為0，30，40，0，100，500，1 000μg/kg，加蓋并混勻后放置0.5h；按照1.2（b），（c）程序處理，得到0，30，40，50，100，500，1 000μg/kg基質校準曲線；以標準物質峰面積為縱坐標，以標準工作溶液濃度（μg/kg）為橫坐標，繪制標準曲線，外標法定量測定，所得回歸參數（見表4）。結果表明，TTX在40～1 000μg/kg范圍內具有良好的線性關系。

表4 河鲀毒素在添加水平為40～1 000μg/kg時校準曲線的相關參數Table 4 Calibration curve parameters in tetrodotoxin fortified fugu liver samples at range of 40～1000μg/kg

2.5 最低檢測限測定

稱取河鲀魚肝臟樣品1.00g（精確到0.01g），加入適量標準液，使樣品中TTX的濃度水平為30，40，50 μg/kg，每個水平有3個平行樣，按1.2（b），（c）程序處理后進HPLC-MS/MS測定。添加水平為40μg/kg的提取液中的TTX的定性定量離子信噪比均＞3；添加水平為50μg/kg的溶液，測得TTX定量離子的S/N皆大于10（見表5），以被測化合物的響應值信噪比≥3時所對應的含量作為檢測限，信噪比大于10作為定量限；表明本方法中TTX的檢出限和定量限分別達到40和50μg/kg。

表5 TTX的檢出限測定參數Table 5 Signal-to-noise ratios in determination of tetrodotoxin in fugu liver samples by HPLC-MS/MS（spiked level at 40μg/kg（LOD）＆50μg/kg（LOQ））

2.6 方法的回收率和精密度

等量稱取18個（1.00±0.01）g陰性河鲀魚肝臟樣品于50mL聚丙烯離心管中，分為3組，分別加入適量標準工作液，使3組樣品中TTX的含量分別為50，75，100μg/kg，加標樣品按步驟1.2（b），（c）處理后進HPLC-MS/MS測定?；|匹配標準工作曲線進行外標法定量，回收率和精密度數據見表6。用空白基質進行回收率和室內精密度實驗，在添加水平為50，75，100 μg/kg時，TTX的平均回收率分別為83.0%～102%，79.2%～105.3%，89.3%～97.7%；TTX的總體變異系數分別為：8.6%，9.0%和3.4%。

2.7 實際樣品檢測

應用本方法對13份河鲀魚肝臟樣品進行檢測，其中1＃～3＃樣品為野生暗紋東方鲀肝臟（體長分別為6.0，15.0，16.5cm），4?！?3＃肝臟樣品取自人工養殖紅鰭東方鲀（體長11.5～25.5cm）。測定結果見表7。結果顯示，野生河鲀肝臟中TTX濃度遠高于人工養殖品種，TTX含量與河鲀魚體形大小成一定比例關系。

圖7 空白以及加標河鲀魚肝臟樣品總離子流圖Fig.7 TIC of blank and spiked fugu liver samples

表6 加標河鲀魚肝臟樣品的平均回收率和精密度實驗結果（n＝18）Table 6 The average recoveries and of precisions of tetrodotoxin in fortified fugu liver samples（n＝18）

表7 河鲀魚肝臟樣品中河鲀毒素含量實測值（n＝3）Table 7 Determined concentration of tetrodotoxin in fugu liver samples

3 結語

本文建立了快速檢測河鲀魚肝臟中TTX含量的高效液相色譜－質譜/質譜檢測方法，樣品處理過程采用1%乙酸甲醇提取，樣品提取液經正己烷脫脂以及C18和GCB混合吸附劑QuEChERS凈化后直接進樣分析。與文獻0.2%乙酸水提取和SPE凈化以及超濾等方法相比，該方法改進了基質效應問題，具有結果可靠、靈敏高、重現性好；操作簡單、低成本、省時高效的優點，滿足目前河鲀魚肝臟樣品中TTX含量快速檢測的技術要求。

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