木質素降解細菌的分離與生化特性研究

文/屈森虎 楊 磊 陳 媛

前言

木質素的資源十分豐富，是植物光合作用制造的總量僅次于纖維素的有機化合物，估計全球的木質素年產量可達到1500億噸。然而，木質素資源并沒有得到有效的利用，大量的木質素作為造紙工業的副產物而排放，不僅是資源的一大浪費，而且嚴重污染環境。采用物理和化學處理法，可減少約50% 的木質素排放，但治理成本高，易造成二次污染。利用生物技術降解木質素，可以減少環境污染，變廢為寶，實現資源再利用。因此，認識木質素的結構特點和了解其生物降解的研究進展，對于木質素資源的合理化利用將具有一定的指導意義。

概況

木質素（lignin）是由四種醇單體（對香豆醇、松柏醇、5-羥基松柏醇、芥子醇）形成的一種復雜酚類聚合物。木質素是構成植物細胞壁的成分之一，具有使細胞相連的作用。在植物組織中具有增強細胞壁及黏合纖維的作用。其組成與性質比較復雜，并具有極強的活性。不能被動物所消化，在土壤中能轉化成腐殖質。如果簡單定義木質素的話，可以認為木質素是對羥基肉桂醇類的酶脫氫聚合物。

實驗步驟

兩種不同來源：木質素黑液、經木質素黑液馴化4個月后的土壤。

LB培養基：酵母浸膏5.0g、蛋白胨10.0g、氯化鈉5.0g、瓊脂19.0g、蒸餾水1000ml。

方法：（1）木質素黑液的配制：稱取11.0125g粗木質素，加水定容至1000ml，作梯度稀釋10-1、10-2、10-3。每個梯度做3個樣。（2）制作平板。LB-培養基：培養皿編號后，將已融化并冷卻至50℃左右的培養基倒入培養皿中。RB-LB培養基：將滅菌后一定體積濃度為5mg/ml 的RB亮藍溶液與滅菌后冷卻到60℃左右的LB培養基混勻（圖1所示）。（3）將木質素黑液接到RB-LB平板上，分別進行梯度稀釋10-1、10-2、10-3 、10-4、10-5 。取5個樣，每個樣品制作2個平行樣品，一共10個樣品。再從RB-LB培養基上挑出有顏色變化的菌落接到LB培養基的平板上，進行分離提純，篩出來純種菌落。（圖2所示）

細菌的木質素降解率的測定

培養基：無機鹽培養基 L-MSM。

磷酸氫二鈉2.4g、磷酸氫二鉀2.0g、硝酸銨0.1g、硫酸鎂0.01g、氯化鈣0.01g、葡萄糖10g、蛋白胨5g、trace element solution 1ml、Kraft Lignin500mg、蒸餾水1000ml、PH 7.6 。

方法：在250ml錐形瓶中加入約100ml的L-MSM液體培養基，接入經過一夜液體培養的菌液1ml，一共做3個平行的錐形瓶，不接入的L-MSM培養基作為空白組，然后放入搖床培養（120rpm，30℃）。連續培養十四天，每天定期取樣測定降解率，分別取空白組和實驗組各30ml，在8000r/min的條件下，離心15min，去取上清液并用HCl酸化至PH1-2，然后去離心（8000r/min，離心30min），從而得到酸沉物，拿去烘干（60-65℃，條件下烘48h），最后稱重。（其中假定空白組最后烘干得到的重量為100%）。

計算結果

FPA酶活力按下式計算：

X1=A×1/0.5×n

式中：

X1—樣品的濾紙酶活力（FPA），u/g（或u/ml）；A—根據吸光度在標準曲線上查的（或計算出）的還原糖量，m g；1/0.5—換算成酶液1ml；n—酶樣的稀釋倍數。

圖1 RB-LB培養基

圖2 篩選后的純種菌落

結語

本文的主要內容是進行木質素降解細菌的分離與生化特性研究，從細菌的篩選與提純、測定細菌的木質素降解率、酶活等實驗進行了分析與研究，得出了以下結論。

（1）篩菌結果：細菌的來源分別為木質素黑液與經木質素黑液馴化4個月后的土壤，通過接菌、梯度稀釋進行分離提純，篩出來純種菌落，得到13個細菌。（2）細菌的木質素降解率：將經過一夜培養的菌液加入到無機鹽培養基中，并加一個空白做對照，由測得的質量計算得出每天的降解率。通過對13種細菌進行數據對比，可以看出1、4、10、11、12、13號菌的木質素降解率比較高，說明它們的降解效果較其他細菌更明顯。（3）細菌的纖維素酶活：纖維素酶是指在各種酶組分的協同作用下，能降解纖維素酶、使之變成纖維寡糖、纖維二糖和葡萄糖的酶。測定酶活采用的是纖維素酶制劑QB2583-2003，培養基為產酶培養基，分別測第二、第四、第六、第八、第十天酶活。酶活高說明其還原糖含量高，從實驗數據可分析得出1、2、3、4、11、12號這五種菌的酶活較優秀。（4）細菌的微生物鑒定：根據細菌的木質素降解率與酶活數據挑選出1、4、11號三種菌進行微生物鑒定，結果為：1號菌是無色桿菌、4號菌是木糖氧化無色桿菌、11號菌是溶血性葡萄球菌。（5）生物強化實驗結果：測定COD采用的是參見國標GB11914-89。結果從曲線圖可以明顯看出1、11號細菌第七天測的COD比不加菌的都高，而4號菌比其他三個都小很多。因此，單從數據上比較，4號菌的優勢相對大一些，說明4號菌的降解能力較為優秀。測定色度采用的是GB11903-89，把13種細菌接入用秸稈粉末作為碳源的培養基，經過十天錐形瓶內顏色有明顯差異，其中3、4、7、8、11、12這幾種細菌接入培養基后顏色比其它菌要淡很多。說明這幾種細菌對于木質素降解是有效果的。

綜上所述，4號菌木糖氧化無色桿菌降解能力最為優秀。