黃芪注射液對大鼠皮層神經細胞缺氧性凋亡的影響

孟傳萍，劉 東，張淑華，趙姣姣

(1寧津縣人民醫院，山東德州253400;2青島大學醫學院附屬醫院)

黃芪作為一種傳統中藥，生用可益衛固表、破血逐瘀、托毒生肌，灸用可補中益氣［1］。近年研究發現，黃芪對缺血再灌注損傷有保護作用，其可通過減少自由基生成、增加腦血流量，進一步減輕細胞損傷［2，3］。缺血缺氧導致的神經細胞凋亡是腦梗死和腦出血等疾病重要的病理基礎［4］。2013年6月～2013年12月，我們觀察了黃芪對大鼠神經細胞缺氧性凋亡的影響，現分析結果，并探討其可能的作用機制，旨在為黃芪注射液在腦缺氧缺血性疾病治療中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 大鼠神經細胞分離與培養 出生20 h內雌性SD大鼠24只，體質量2～8 g。脫臼法處死大鼠，眼科剪剪取大鼠大腦，取出大腦皮質，分成1 mm3的小塊，室溫下消化20 min，用10%FBS終止其反應，用培養基清洗2次，滴加完全培養基吹打，靜置10 min，吸取上清細胞懸液過70 μm尼龍網篩，血計數板計數細胞，以3×105/mL密度接種于96孔培養板，每孔分別加入0.1 mL，培養板置培養箱中培養4 h，后吸取培養基，繼續加入2%B27Neurobasal培養液培養，3 d后半量換液。

1.2 缺氧性凋亡細胞模型制備與分組處理 將細胞分為對照組、模型組、黃芪組，對照組及模型組每組4個復孔，黃芪組12個復孔。對照組常規飼養，模型組、黃芪組參照文獻［4］制作缺氧性凋亡細胞模型:將神經細胞置于缺氧罐中，通入95%N2和5%CO2的混合氣體，流量為 2.0 L/min，持續20 min，封閉的缺氧罐置培養箱中培養，12 h后將細胞從缺氧罐中取出，放入培養箱中復氧后繼續培養。制模后黃芪組分別加入1、10、100 μg/mL的黃芪注射液(每濃度4個復孔);模型組及對照組不加入藥物。

1.3 相關指標觀察

1.3.1 細胞形態學變化 處理后6 h吸去板內培養基，將100 μg/mL 丫碇橙(AO)和 100 μg/mL 嗅乙啶(EB)等量混勻，每孔分別加入10 μL后靜置10 min，熒光顯微鏡下觀察細胞形態學變化。

1.3.2 細胞超微結構改變 處理后6 h收取細胞，離心機富集后棄上清，4℃預冷，戊二醛固定，2 h后PBS洗滌，鋨酸固定，梯度乙醇丙酮脫水，常規包埋、聚合、超薄切片、鉛染，透射電鏡下觀察凋亡細胞超微結構變化。

1.3.3 細胞凋亡情況 處理后12、24 h取各組細胞冷PBS液清洗2次，加入70%的乙醇4℃固定過夜。離心機離心，棄去上清，加入 TritonX-100及RNaseA 各200 μL，15 min 后加入 PI染料 1 mL，室溫下避光靜置15 min，于流式細胞儀進行熒光檢測(激發波長490 nm，發射波長670 nm)，計算細胞凋亡率。

1.3.4 Bcl-2、Caspase-8蛋白表達 采用 Western blot法檢測。各組處理后6 h取各組細胞，RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，PBS調整蛋白終濃度為1 μg/μL，用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉移至PVDF膜，脫脂奶粉封閉，2 h后放入兔抗人Bcl-2、Caspase-8單克隆抗體，4℃孵育過夜，加入堿性磷酸酶標記的二抗(羊抗兔)室溫孵育2 h，滴加ECL液顯色，最后進行曝光拍照。各組蛋白表達與內參GAPDH相比，計算相對表達量。

1.4 統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行統計學分析。計量資料用±s表示，重復測量數據比較采用多因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞形態與超微結構 熒光顯微鏡下，AO染色的細胞核呈黃綠色光，可濃聚成顆粒狀，多位于細胞一側，EB染色的晚期凋亡細胞核呈桔紅色，濃聚或偏向，還可見少數細胞核碎裂成塊狀。10 μg/mL黃芪處理的細胞少量顆粒聚集在細胞一側，核呈淡黃綠色;100 μg/mL黃芪處理的細胞凋亡數明顯減少，核呈淡黃色，幾乎看不到核碎裂象。電鏡下，模型組大鼠皮層神經細胞可見細胞邊緣起泡出芽、膨出，部分凋亡細胞內觀察到凋亡小體;黃芪組中100 μg/mL黃芪處理的細胞呈卵圓型，邊緣有少量微絨毛，胞質內線粒體可觀察到線粒體峭，核糖體存在于粗面內質網表面，細胞核內可見核仁，細胞染色質正常。

2.2 神經細胞凋亡情況 各組神經細胞凋亡率見表1。黃芪組、模型組細胞凋亡率高于對照組(P均＜0.05)，但黃芪組神經細胞凋亡率低于模型組，且凋亡率隨黃芪濃度的增加而減少(P均＜0.05)。

表1 各組神經細胞凋亡率比較(n=4，%，±s)

表1 各組神經細胞凋亡率比較(n=4，%，±s)

注:與對照組相比，*P ＜0.05;與模型組相比，#P ＜0.05;與黃芪組1 μg/mL 相比，△P ＜0.05;與黃芪組10 μg/mL 相比，☆P ＜0.05

組別 細胞凋亡率12 h 24 h 5.18 ±0.29 7.81 ±0.40黃芪組1 μg/mL 18.95 ±0.39*# 28.23 ±1.46*#10 μg/mL 14.20 ±0.62*#△ 19.12 ±0.58*#△100 μg/mL 11.41 ±0.95*#△☆ 13.86 ±0.37*#△模型組 21.57 ±1.21* 32.43 ±1.98*對照組

2.3 細胞Bcl-2、Caspase-8表達 黃芪組、模型組Bcl-2表達均低于對照組，但黃芪組高于模型組，且Bcl-2表達隨黃芪濃度的增加而增加(P均＜0.05)。黃芪組、模型組Caspase-8表達高于對照組，但黃芪組低于模型組，且Caspase-8表達隨黃芪濃度增加而降低(P均＜0.05)。見表2。

表2 各組細胞Bcl-2、Caspase-8表達比較(n=4，±s)

表2 各組細胞Bcl-2、Caspase-8表達比較(n=4，±s)

注:與對照組相比，*P ＜0.05;與模型組相比，#P ＜0.05;與黃芪組1 μg/mL 相比，△P ＜0.05;與黃芪組10 μg/mL 相比，☆P ＜0.05

組別Bcl-2 Caspase-8 1.35 ±0.37 0.29 ±0.10黃芪組1 μg/mL 0.37 ±0.15*# 0.87 ±0.25*#10 μg/mL 0.85 ±0.28*#△ 0.72 ±0.29*#△100 μg/mL 1.21 ±0.22*#△☆ 0.31 ±0.06*#△☆模型組 0.24 ±0.05* 0.98 ±0.35*對照組

3 討論

腦缺血缺氧性疾病臨床常見，神經細胞缺氧性凋亡是其重要病理學改變［5］，逆轉凋亡為該類疾病重要的治療原則［6］。現代藥理學研究表明，黃芪可使減少的血細胞恢復正常，擴張冠狀動脈，改善心臟功能，加強抗缺氧能力，防止脂質過氧化，改善腎臟功能，防止肝糖原減少，還有抗衰老的功能［7］。近年來研究表明，黃芪有抗缺血再灌注損傷的作用，可改善缺血缺氧后腦血流量、減少自由基的生成、降低興奮性氨基酸毒性，從而減輕細胞損傷［8，9］。

本研究采用對缺血缺氧十分敏感的大鼠皮層神經細胞進行原代培養，構建缺氧性凋亡模型。結果顯示模型組細胞活性均明顯下降，可見大量凋亡細胞。各黃芪干預組細胞凋亡率均低于模型組，且細胞凋亡率隨黃芪濃度增加而降低，100 μg/mL的黃芪作用最明顯。這表明黃芪注射液可抑制缺氧神經細胞凋亡，對缺氧后神經系統康復有一定幫助。

研究發現細胞凋亡與多種基因調控有關，其中Bcl-2蛋白家族在細胞凋亡中發揮重要作用［10，11］。Bcl-2蛋白可通過調控Ca2+濃度，保持其動態平衡［12］。細胞凋亡依賴于對天冬氨酸特異的Caspase，進而產生級聯反應，而Caspase-8是死亡受體介導的凋亡途徑中關鍵的啟動因子［13，14］。其通過寡聚而自身切割活化，進一步激活下游半胱氨酸蛋白酶，產生凋亡效應［15，16］。本研究發現黃芪能使缺氧神經細胞中Bcl-2表達增加，Caspase-8表達降低，且高濃度黃芪組作用更為明顯，提示黃芪的抗神經細胞凋亡作用可能與調控Bcl-2、Caspase-8表達有關。本研究結果可為臨床上使用黃芪提取物治療等缺氧性腦病提供理論依據。

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