基因組重排技術及其在真菌育種中的應用

王麗寧，趙 妍，奚麗萍，陳明杰，*（.上海市農業科學院食用菌研究所，上海市農業遺傳育種重點開放實驗室，農業部南方食用菌資源利用重點實驗室，國家食用菌工程技術研究中心，上海20403；2.上海海洋大學食品學院，上海20306）

基因組重排技術及其在真菌育種中的應用

王麗寧1，2，趙 妍1，*，奚麗萍1，陳明杰1，2，*
（1.上海市農業科學院食用菌研究所，上海市農業遺傳育種重點開放實驗室，農業部南方食用菌資源利用重點實驗室，國家食用菌工程技術研究中心，上海201403；2.上海海洋大學食品學院，上海201306）

基因組重排（genome shuffling）是一種快速提高細胞表型的新穎的全基因組工程方法，它是基于多親本的原生質體遞歸融合，提供了在缺少基因組序列數據或網絡信息情況下的全基因組重組的優勢。文中介紹了基因組重排的原理、優點及過程，概述了基因組重排在真菌育種中的應用，并展望了該技術的前景。

基因組重排，遞歸原生質體融合，真菌育種

育種技術的發展經歷了自然選育、誘變育種、雜交育種、原生質體融合育種、基因工程育種等幾個階段[1-2]，其中自然選育、誘變育種及雜交育種屬于傳統的育種方法。盡管傳統的育種方法曾經發揮著巨大的作用[3-5]，但存在工程量巨大、耗時長且難于獲取復雜表型的缺點。自從轉基因技術問世以來，轉基因微生物的研究取得了重大的進展[6]，但基因工程育種需要對目的菌株的遺傳背景有較為深刻的了解，這在一定程度上限制了其應用。基因組重排（genome shuffling）又稱基因組重組或基因組改組，是一種基于原生質體遞歸融合的新型分子育種技術[7-9]，是分子定向進化在全基因組水平上的延伸，它將重組的對象從單個基因擴展到整個基因組，從雙親本擴展到多親本，從一輪原生質體融合擴展到多輪原生質體融合，因此可以對菌株的目的性狀進行更快以及更大范圍的優化組合。基因組重排技術提出后，在細菌、放線菌以及真菌的育種上都展現出獨特的優勢，取得了較好的研究成果。

1 基因組重排的原理及優點

1.1 基因組重排的原理

基因組重排是將具有不同表型的菌株進行全基因組重組的一種手段，進行基因組重排首先需要構建一個含有各種不同正突變的基因組庫（例如通過經典的誘變育種得到目的性狀發生改進的不同的正突變菌株就構成了所需的基因組庫），隨后將選出的若干個正向突變株作為出發菌株，通過原生質體融合將這些正突變菌株的基因組進行隨機重組，并篩選目的性狀得到進一步改進的菌株來進行下一輪基因組重排，這樣通過循環多輪的隨機重組可以快速、高效地選育出表型得到較大改進的新菌種。

1.2 基因組重排的優點

與傳統的育種方法相比，基因組重排具有更高的效率。人工選擇育種對自然條件依賴性強、耗時長、效率低；誘變育種正向突變率很低，篩選一株優良的生產菌株需要大量的時間和工作量，且連續的誘變會使菌株產生“疲勞效應”；原生質體融合技術可以扮演類似于有性生殖途徑基因信息交流的作用，但僅限于雙親本之間的重組。基因組重排技術基于多親本之間的遞歸融合，具有更大基因突變來源，遞歸融合還能使正向突變的表型聚集，多輪融合極大地提高了基因交換的概率。Zhang等[7]發現2輪基因組重排取得的成果相當于20年經典育種才能完成。綜上所述，擴大菌株的基因型和加速菌株進化速度是基因組重排技術最大的優勢。此外基因組重排技術在無需了解微生物代謝途徑、關鍵酶的表達基因、轉錄調控等背景知識的前提下，即可應用于菌株改良，尤其適合微生物代謝途徑的遺傳改造[10]，并且基因組重排技術具有操作簡單、易推廣、見效快等特點。

2 基因組重排的過程

簡單來講基因組重排的過程，即從親本庫中選擇性狀優良的菌株作為首輪融合的親本進行融合，獲得第一代融合株后，從中篩選出目的性狀改進的菌株作為第二輪融合的親本，以此類推進行多輪融合，主要包含以下操作步驟：

2.1 構建親本庫

親本庫即基因組重排中進行首輪原生質體融合的親本集合體，包含了不同較好的性狀以及多樣性的差異。構建親本庫的方式主要有以下幾種。

a.由突變體構建：從同一原始菌株出發，經理化誘變獲得不同的正突變體。劉源慧[11]對米曲霉（Aspergillus oryzae）FS-16分別進行紫外誘變和微波誘變，選取4株α-淀粉酶產量提高的突變株與原始菌株FS-16作為親本進行重排，得到了α-淀粉酶酶活顯著提高的重組子。

b.由種內不同菌株構建：同一種內的不同菌株，事實上可以看作是同一種微生物的不同自然突變體，其基因差異、融合頻率以及融合子表型多樣性都要優于同一菌株的不同突變體，這對優秀性狀的整合或許更加有效。Gong等[12]從自然界中篩選了5株產乙醇量較高的釀酒酵母（Saccaromyce scerevisiae）來構建親本庫，經基因組重排后得到的新菌株乙醇產量提高了2倍。

c.由不同種、屬菌株構建：來自不同種、屬的菌株，遺傳差異相對更大，為融合后代提供了更豐富的基因型。Zhao等[13]對輪枝霉（Diasporangium sp.）與黑曲霉（Aspergillus niger）進行基因組重排，獲得了花生四烯酸產量提高的新菌株。

d.由DNA重組技術構建：該方法在細菌中已有研究報道，但目前在真菌中應用較少。

2.2 融合與融合子的篩選

2.2.1 原生質體的制備與融合 原生質體的制備是融合的前提，制備原生質體主要參考的因素有菌齡、酶的種類、酶的濃度、酶解時間、溫度、滲透壓穩定劑、pH及再生培養基的設計等[14-16]。誘導原生質體融合的方式有生物病毒法、化學法及電處理融合法等，其中化學法和電處理融合法是當前最主要的促融方法。隨著科學技術的進步，出現了一些新型的誘導原生質體融合的方法。Gong等[17]用飛秒激光誘導紅發夫酵母（Phaffia rhodozyma）進行細胞融合，在功率1.38×104W處理0.25s的情況下，酵母融合率達到了80%。Skelley等[18]運用微流體技術對細胞配對和融合進行誘導，能正確配對和融合的細胞比例超過了50%，顯著提高了融合效率。

2.2.2 融合子的篩選 從融合后產生的大量重組菌株中篩選出目的菌株關系到基因組重排的效率，因此篩選方法變得尤為重要。根據篩選目的不同，篩選方法也多樣。篩選高產物的目的菌株時，主要依靠產物的物理和化學性質，如在瓊脂培養基上的抑菌圈、透明圈及水解圈等。篩選對環境高耐受性的目的菌株時，則可以利用相應的選擇培養基。此外，添加遺傳標記也是一種有效的融合菌株篩選方法。翁艷軍[19]選用Met-缺陷型和Arg-缺陷型分別標記雙親，在基本培養基上篩選出營養互補的融合子。由于營養缺陷型的獲取較為費時耗力，現在多使用滅活原生質體的標記方法，即首先采用熱或者紫外線等手段使原生質體失活，然后用失活的原生質體進行融合，這種標記方法又分為單親原生質體滅活和雙親原生質體滅活。Kang等[20]分別利用紫外線和熱滅活處理的親本進行基因組重排研究，最終獲得了表型理想的融合子。由于紫外線滅活損傷的主要是染色體，熱滅活損傷的是細胞質，因此具有不同損傷位點的原生質體融合后通過互補作用能夠再生，大大簡化了融合子的篩選工作。近年來隨著科學技術的發展，一些高通量的篩選方法和分析技術不斷涌現，如液相色譜—質譜法、熒光激活細胞分選技術等，這些新技術顯著提高了目的融合子的篩選效率。

2.2.3 遞歸融合 遞歸融合即從首輪重排的融合子中選出性狀得到改進的融合子作為下一輪的親本，將其制成原生質體再進行融合，重復以上步驟直至得到理想的融合子。遞歸融合的要義在于進行一輪融合后篩選出的融合菌株作為出發菌株，必須進入下一輪融合。

3 基因組重排在真菌育種中的應用

基因組重排技術經過十幾年的發展，在真菌育種上已經有了諸多成功的應用，尤其在工業微生物的育種上發揮了重要的作用，并且體現出越來越顯著的優勢。

3.1 利用基因組重排技術提高真菌對環境的耐受性

真菌對環境的耐受性主要表現在以下幾個方面：對產物的耐受性、對基質的耐受性、對副產物的耐受性、對生長環境（如溫度、pH及溶劑等）的耐受性。基因組重排在改善真菌的耐受性方面比傳統育種方法體現出更多的優勢。El-Bondk ly[21]對海洋真菌曲霉菌（Aspergillus Sp.NRCF5）進行2種組合的復合誘變（亞硝基胍與紫外線、亞硝基胍與溴化乙錠）后，從中選出5株具有最高脫氧葡萄糖（2DG）耐受性的誘變株進行了4輪基因組重排，逐步將曲霉菌NRCF5對2DG的耐受性由0.1%（w/v）提高到1.0%（w/v）。酵母作為一類重要的可利用真菌，研究者們以它為實驗材料，借助基因組重排技術選育出多個對環境耐受性強的新菌株。Wei等[22]通過4輪基因組重排過程，提高了克魯斯假絲酵母（Candida krusei）對醋酸的抗性，同時對過氧化氫、熱及凍融的抗性都有所增加；Shi等[23]運用基因組重排技術，將工業酵母菌株SM-3的最高生長溫度提高了20℃，對乙醇的耐受性提高了15%；Param jit等[24]對樹干畢赤酵母（Pichia stipitis）進行4輪基因組重排后，發現其對硬木亞硫酸鹽廢液（HW SSL）的耐受濃度由65%（v/v）提高到了80%（v/v）以上，且重組子能更好地利用木糖和葡萄糖，產生更多的乙醇。這些研究結果表明，基因組重排是一種快速且有效提高真菌多重抗性的方法。

3.2 利用基因組重排技術提高真菌產物產量

很多真菌化合物對人類非常有益，如乙醇、酶、多糖等[25-27]，因此提高真菌代謝產物的產量可以在一定程度上擴大這些物質的來源、縮短制造周期、降低生產成本。然而代謝產物產量的提高依賴于基因水平上多個位點的協同變化，運用傳統的方法來提高真菌產物產量工作量大且收獲甚微。基因組重排基于多親本的基因轉移，能夠使目的菌株的優良性狀迅速聚集。Zhao等[28]對樹狀多節孢（Nodulisporium sylviform）進行4輪基因組重排，獲得了3株遺傳性穩定的高紫杉醇生產菌株，采用薄層色譜法、高效液相色譜法以及液質聯用技術對紫杉醇進行定性和定量分析，發現重組子F4-26的紫杉醇產量為516.37μg/L，比基因組重排的親本菌株提高了31.52%～44.72%。馮印[29]將出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）CICC 140334經誘變后獲得的高產茁霉多糖突變株作為親本進行4輪基因組重排，得到多糖產量比出發菌株提高了104.43%的重組子。此外研究者們還利用基因組重排技術，選育出高產纖維素酶[30]、果糖基轉移酶[31]、中性蛋白酶[32]以及α-淀粉酶[11，33]的融合菌株，使人們對真菌的利用率得到顯著提高。

3.3 利用基因組重排技術提高底物利用率及范圍

在真菌表型工程改造中，真菌對于底物的高效利用能力也是期望獲得的目的性狀之一，真菌利用底物的能力也可通過基因組重排來提高。Kang等[20]將出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）N3.387進行3輪基因組重排后得到菌株F3-2，與野生型菌株相比，新菌株對原材料的利用率提高了29.0%。Zhao等[13]將輪枝霉（Diasporangium sp.）和黑曲霉（Aspergillus niger）作為首輪基因組重排的親本，經過3輪重排后獲得了輪枝霉碳譜擴大的菌株，親本菌株只能利用測試8種碳源中的4種，而重排后的新菌株能夠利用全部的8種碳源，這可能是因為與黑曲霉重組后提高了輪枝霉的羧甲基纖維素酶活性，從而擴大了利用碳譜的范圍。

3.4 利用基因組重排技術提高真菌遺傳多樣性

遺傳多樣性對豐富真菌種質資源、促進真菌進化、提高真菌對環境的耐受性等都具有重要意義。董計巧[34]利用離子束誘變和基因組重排技術對斜臥青霉（Penicillium decumbens）JUAIO-1進行改造，并采用RAPD技術對融合子及其出發菌株開展了遺傳相似性分析，研究結果表明融合菌株和出發菌株既有遺傳相似性，又在基因組水平上發生了改變。林峻等[35]對堿性脂肪酶產生菌擴展青霉（Penicillium expansum）FS8486菌株和溜曲霉（Aspergillus Tamarii）FS-132進行2輪基因組重排，得到的重組子中酶活最高者較出發菌株FS8486提高了317%，在對親本及子代菌株進行RAPD多態性分析時，發現經基因組重排的兩子代菌株間的遺傳距離（0.6593）要大于兩親本間的（0.544），表明基因組重排確實能夠有效提高子代菌株的遺傳多樣性。

4 展望

基因組重排依賴于相對成熟的原生質體融合技術，在傳統育種方法所提供的遺傳多樣性親本的基礎上，通過全基因組水平上的重組使得某一或某些優良性狀集聚在后代中，為真菌菌種的性狀改良提供了一個有利的平臺。而正突變基因組庫的建立是基因組重排的前提條件，其多樣性以及與育種目標的相關性直接關系到重排的成功與否，因此在正突變基因組庫的構建方面可能需要更多的探索。多親本融合依賴于有效的融合方法以及高效的融合子篩選技術。相較于傳統的化學融合與電融合，雖然新興的融合技術（如激光誘導、微流體技術等）能夠大幅度提高融合效率，但其使用范圍受到限制，技術水平也有待進一步提高與完善。目前普遍使用的熱滅活與紫外滅活標記，雖然可以簡化融合子的篩選，但同樣會給原生質體帶來生理性損傷，影響融合效率，因此融合的標記技術可能需要開展深入研究。與此同時，目前真菌中高效的融合子篩選方法較少，應用水平較低，嚴重制約了基因組重排的效率，因此高通量的篩選方法是實現基因組重排的有力保證。

隨著基因組重排技術的逐步完善以及與其他生物技術的結合，使其在真菌菌種改良中的作用越來越重要，目前基因組重排在酵母[12，14，22-24]、青霉[30，34-35]、曲霉[11，31-33，36]等真菌的育種上已體現出巨大的優勢。食用菌是重要的大型真菌，具有較高的營養價值與保健功能，既可食用也可藥用[37]，因此食用菌菌種的改良具有重要經濟意義，但目前基因組重排技術用于食用菌育種中的研究報道甚少。依據基因組重排在其他真菌菌種改良中所取得的成就，相信其也能夠在培育豐產、高抗的優質食用菌菌種方面發揮獨特的優勢。

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Genome shuffling and its application in fungal-breeding

WANG Li-ning1，2，ZHAO Yan1，*，XILi-ping1，CHEN M ing-jie1，2，*
（1.Institute of Edible Fungi，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding，Key Laboratory of Edible FungiResources and Utilization（South），Ministry of Agriculture of China，National Engineering Research Center of Edible Fungi，Shanghai201403，China；2.College of Food Science&Technology，ShanghaiOcean University，Shanghai201306，China）

The technology of genome shuffling was a novel whole genome engineering app roach for the rapid im p rovement of cellular phenotypes.Based on the recursive p rotop last fusion w ith multi-parental strains，it offers the advantage of recombination throughout the entire genome w ithout the necessity for genome sequence data ornetwork information.This artic le introduced the p rincip le，characteristics and p rocess ofgenome shuffling，summarized its app lication in fungal-b reed ing and p rospec ted the outlook of it.

genome shuffling；recursive p rotop last fusion；fungal-b reed ing

TS201.3

A

1002-0306（2014）18-0362-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.073

2013－12－31 *通訊聯系人

王麗寧（1990-），女，碩士研究生，研究方向：食藥用菌遺傳育種。

國家食用菌產業技術體系[CARS-24]。