過敏組學的研究概況及其在食物過敏中的應用

佟 平，胡艷連，高金燕，李 欣，，楊安樹，吳志華，，陳紅兵，，*（.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌007；.江西省宜春市人民醫院，江西宜春6000；.南昌大學生命科學與食品工程學院，江西南昌007；.南昌大學中德聯合研究院，江西南昌007）

過敏組學的研究概況及其在食物過敏中的應用

佟 平1，胡艷連2，高金燕3，李 欣1，3，楊安樹4，吳志華1，4，陳紅兵1，4，*
（1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌330047；2.江西省宜春市人民醫院，江西宜春336000；3.南昌大學生命科學與食品工程學院，江西南昌330047；4.南昌大學中德聯合研究院，江西南昌330047）

近年來，食物過敏現象日益普遍，引起過敏的蛋白日益受到關注，過敏組學應運而生。本文就過敏組學的概念、過敏組學的研究方法以及過敏組學在食物過敏中的應用做了介紹。

過敏組學，過敏原，食物過敏

組學技術是近年來在生物及醫學領域快速發展，并受到高度重視的現代分析技術。“組”的概念來源于希臘語，最初用于基因組，指一個物種的全部遺傳組成。發展到現在，“組”的使用已經擴展到其他相關領域，如蛋白質組、代謝組等。隨著過敏現象的日益增多，過敏原蛋白日益受到關注，人們對過敏原蛋白開展了大量的研究，過敏組學應運而生。

1 過敏組學概念的提出

過敏組學（allergenomics）的概念最早見諸于文獻是在2004年的《International Archives of Allergy and Immunology》雜志上，由Yagami等提出[1]。他們指出傳統的分析過敏原蛋白的方法通常是先分離出各個過敏原蛋白，然后對過敏原蛋白進行鑒定，再對其致敏性進行表征。這一過程非常繁瑣、耗時，并且工作量大。而隨著蛋白質組學技術的發展，以及蛋白質序列庫的完善，運用蛋白質組學技術來分析潛在的過敏原成分將會是一種簡單快速的方法。他們通過運用蛋白質組學技術對乳膠中的潛在過敏原進行識別驗證，證實了運用蛋白質組學的方法研究過敏原是一種快速全面分析潛在過敏原的有效途徑。因此，他們結合了過敏原（allergen）和蛋白質組學（proteomics）兩個單詞，提出過敏組學（allergenomics）這一概念，即運用蛋白質組學方法來解析過敏原蛋白的一門學問。隨后，過敏組學概念開始被引用。

2 過敏組學常用的研究方法

過敏組學的研究方法包括蛋白質組學研究的三大支柱技術——雙向電泳（two-dimensional electrophoresis，2-D電泳）、質譜（mass spectrometry，MS）和生物信息學，以及免疫學技術——免疫印跡。其中，以2-D電泳、免疫印跡技術和MS技術為支撐平臺，用于過敏原蛋白的分離、鑒定，以生物信息學為橋梁，利用計算機系統和生物學軟件進行大規模的數據處理，對潛在的過敏原蛋白進行解析。

2.1 雙向電泳

2-D電泳是20世紀70年代O’Farrell建立的蛋白質分離技術[2]，是等電聚焦電泳（isoelectric focusing，IEF）和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophresis，SDS-PAGE）的組合，即先利用IEF的方法分離等電點不同的蛋白質，再通過SDS-PAGE將分子量不同的蛋白質在二維平面上分開，從而達到有效分離蛋白質的目的。最初，由于IEF在兩性電解質膠管中進行，存在操作復雜、聚焦時間長、pH不穩定、陰性漂移等缺陷，自20世紀80年代開始，通過采用固定化pH梯度膠，克服了載體兩性電解質陰極漂移等許多缺點，并且可隨意精確設定pH梯度，提高了實驗的穩定性、重復性及分辨率，這是雙向凝膠電泳技術上的一個非常重要的突破。

2.2 免疫印跡

免疫印跡技術是一種將凝膠電泳和免疫分析技術有機地融為一體的分析技術，是蛋白電泳技術的延伸和發展。該技術由Towbin等首次介紹[3]，隨后被迅速傳播，應用非常廣泛。其原理是混合樣品經凝膠電泳后分離，凝膠中的蛋白質用電印跡方法被轉移到化學惰性的高分子轉移膜上。然后，將目的蛋白的特異性一級抗體（一抗）與轉移膜上的目的蛋白進行免疫結合反應，再用標記過（如辣根過氧化物酶標記）的二級抗體（二抗）與一抗結合，利用對二抗分子中標記物的檢測證明目的蛋白的存在。

2.3 質譜

質譜是帶電原子、分子或分子碎片按質荷比（或質量）的大小順序排列的圖譜，由Thomson發明。其原理[4]是將樣品離子化后，根據各離子間質荷比（m/z）的差異分離蛋白質，并確定其相對分子質量，能快速、準確地鑒定蛋白質組分，并準確測定肽和蛋白質的相對分子質量、氨基酸序列和翻譯后的修飾，具有高通量、靈敏度和準確度高、易于自動化等特點，是蛋白質組學、也是過敏組學最主要的鑒定技術。依據蛋白質鑒定質譜電離源的不同分為兩種：基質輔助激光解吸飛行時間質譜（Matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDITOF-MS）和電噴霧離子串聯質譜（electrospray ionization tandem mass spectrometry，ESI-MS-MS），前者利用吸收激光的能量使固相的多肽樣品離子化，得到酶解肽段的分子量，獲得蛋白質的肽質量指紋圖譜，通過相應的數據庫鑒定蛋白質，特別適用于分析多肽和蛋白質的混合物；后者則在噴射過程中利用電場，使液相的多肽樣品離子化，采用串聯質譜的方法，進行肽的測序，不僅能獲得肽段質量，而且能獲得肽段氨基酸序列信息。目前，這兩種質譜在過敏組學中都有廣泛的應用。

2.4 生物信息學

生物信息學的核心是蛋白質數據庫的建立和完善。通過對生物學實驗數據的獲取、加工、存儲、檢索與分析，解釋數據所蘊含的生物學意義，同時為蛋白質的鑒定、結構分析和功能預測提供依據。生物信息學技術與蛋白質組學技術結合主要對差異蛋白質進行篩選和鑒定。許多國家和地區的研究機構都建立了自己的蛋白質數據庫，其中最具代表性的是SWISSPROT，為世界上使用最廣泛的蛋白質序列數據庫[4]，可提供蛋白質的功能、結構域、翻譯后的修飾、突變體的描述等信息，并且這些信息會及時更新。

3 過敏組學在食物過敏中的應用

3.1 識別潛在的食物過敏原

運用過敏組學技術識別潛在的過敏原，主要是利用2-D電泳與免疫印跡相結合，首先復雜蛋白質混合物通過IEF和SDS-PAGE電泳有效分離，再通過電轉技術將分離的蛋白轉移至PVDF膜上，然后利用過敏患者血清來檢測與過敏患者血清中IgE結合的蛋白，從而確定潛在的致敏蛋白。這種方法可有效地分離蛋白，同時可全面檢測出多種與IgE結合的潛在過敏蛋白。在此基礎上，結合質譜技術可對識別的潛在過敏原蛋白進行定性分析，通過比對蛋白質數據庫，鑒定出潛在過敏原的蛋白質種類。目前該組合技術已廣泛被應用。如Beyer等利用2-D免疫印跡與質譜測序的方式鑒別出了榛子過敏原Cor a 9[5]。Pastorello等也利用該組合技術鑒別出了6種玉米過敏原，并發現其中兩種過敏原與葡萄可能存在交叉反應[6]。Boldt等[7]和Chassaigne等[8]分別利用2-D電泳和不同的質譜方法鑒別出了花生過敏原Ara h 1，Ara h 2，Ara h 3，Ara h 4及Ara h 3的同分異構體。Akagawa等[9]和Sotkovsky等[10]也分別利用不同的質譜技術分別鑒別出了4種小麥過敏原和19種小麥過敏原。此外，該技術還被用于鑒別蝦[11]、雞蛋[12]過敏原，以及一些不常引起過敏的食物中的過敏原，比如桃子[13]、板栗[14]、西紅柿[15]、萵苣[16]等。但該技術也存在一定的缺陷，即所識別的只是潛在過敏原，而不能確定所識別的一定是過敏原。因為利用該技術所識別的蛋白雖然能與過敏患者血清中的IgE結合，但并不是所有能與IgE結合的蛋白都具有致敏性。過敏原除了必須能與過敏患者血清中的IgE結合，還要能與肥大細胞和嗜堿性粒細胞上的IgE受體（FcεRⅠ受體）結合。因此，要想利用過敏組學技術確認所識別的蛋白是否具有致敏性，還需進一步采取口服激發或者皮試來驗證。

3.2 定量加工食品中的過敏原含量

非常微量的過敏原也可能引起嚴重的過敏反應。因此，目前許多國家都要求食品生產廠家在食品包裝上標明過敏原成分。由于在食品生產過程中可能存在過敏原交叉污染，加工食品中過敏原種類及含量的檢測就變得尤為重要。ELISA是常用檢測食物組分中過敏原含量的一種方法，但由于該方法需要使用過敏原特異性的抗體，限制了它的應用。在過敏組學中，通過選擇過敏原蛋白的特征肽段進行質譜的多反應監測，也可以對食品中的過敏原進行定性和定量檢測。比如Careri等利用LC-ESI-MS/MS技術建立了一種基于檢測目標肽來定量食物中花生過敏原的方法[17]。他們首先利用LC-ESI-Q TOF MS/MS技術從花生過敏原Ara h 2和Ara h 3/4中找出四個花生過敏原特征肽，然后利用這四個特征肽及質譜中的選擇反應監測技術來篩查食品中的花生過敏原，利用外標法檢測了食物樣品中花生過敏原的含量，最低檢測限可達到1μg/g食品。隨后，該技術被分別用于堅果[18-19]、牛奶[20-22]、雞蛋[23]、大豆[24]和蝦[25]等食物中過敏原的定量分析。此外，Heick等利用LC/MS/MS技術建立了一種同時檢測焙烤食物中多種過敏原的方法，也獲得了成功[26]。他們還以面包為例，分別用該方法和商品化的ELISA試劑盒對焙烤前后面包中的牛奶、雞蛋、花生、大豆、榛子、核桃和杏仁7類過敏原進行了檢測，發現焙烤對不同方法檢測出的結果有影響，其中以對面包中牛奶過敏原的檢測影響最大。應用過敏組學方法檢測加工食品中的牛奶過敏原具有較高的檢測靈敏度，而用ELISA方法則檢測不到。因為ELISA方法主要是利用其試劑盒中所含的抗體與加工的食品結合來檢測的，而食品加工方法可能會破壞或者部分破壞食品中與抗體結合的表位，尤其是構象性表位，導致其與抗體結合的能力下降，因而用ELISA方法檢測不出，但這種破壞并不會對質譜分析產生多大影響。此外，在定量加工食品中的過敏原方面，過敏組學方法不會出現像ELISA法中常出現的假陽性和假陰性。由此可見，過敏組學方法在加工食品中痕量過敏原的檢測和定量具有明顯優勢。

3.3 應用過敏組學技術評估新食品的安全性

近年來，隨著轉基因食品種類的豐富和數量的增加，其安全性也引起了廣泛關注。其中轉基因食品的致敏性對于過敏患者來說尤為重要。目前人們利用過敏組學方法對轉基因食品的致敏性進行了大量的研究。Batista等對轉基因大豆的蛋白組進行了研究，并利用2D電泳和免疫印跡技術評估了轉基因大豆的致敏性，結果發現大豆過敏患者對轉基因大豆和非轉基因大豆的識別無差異，但是從轉基因大豆中多識別了2種潛在過敏原[27]。Nakamura等對轉基因土豆的安全性進行了研究，發現轉基因土豆與非轉基因土豆在蛋白表達上略有差異，其中轉基因土豆表達的過敏原馬鈴薯糖蛋白前體的量比非轉基因土豆稍多，但兩者對土豆過敏患者血清中的IgE的識別基本相同[28]。Fonseca等對轉基因玉米MON 810的免疫學性質進行了評估，并發現了在轉基因和非轉基因玉米中均存在14種新的IgE結合蛋白[29]。Thelen團隊利用2-D電泳和質譜技術識別出了大豆、油菜、蓖麻和擬南芥四種油料作物的500多個蛋白，并繪制了相應作物的蛋白圖譜，這些蛋白圖譜可為后續評估轉基因作物的安全性提供有效數據[30]。此外，過敏組學技術還常被用于評估經不同加工方法制作的新食品的安全性，如用面筋蛋白澄清后的紅酒[31]、焙烤的曲奇[18]以及經高壓、焙烤等處理的堅果等[32-37]，這樣的應用研究很多，在此不一一贅述。

4 展望

過敏組學雖然是新近提出的一項組學，但其作為蛋白質組學的一部分，其研究方法已日趨成熟，未來將會有更廣泛的應用，如在食物過敏原的定性和定量方面，可開發更簡單、更精確地定性和定量食物過敏原的方法。此外，可考慮將過敏組學技術與其他技術相結合，在過敏原的篩查與診斷方面做出貢獻。

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Outlines of study on allergenomics and its application on food allergy

TONG Ping1，HU Yan-lian2，GAO Jin-yan3，LI Xin1，3，YANG An-shu4，WU Zhi-hua1，4，CHEN Hong-bing1，4，*

（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China；2.The People’s Hospital of Yichun City，Yichun 336000，China；3.College of Life Sciences and Food Engineering，Nanchang University，Nanchang 336000，China；4.Sino-German Joint Research Institute，Nanchang University，Nanchang 330047，China）

Recently，the number of allergic patients is increasing，and the proteins responsible for allergic reactions have attracted much attention.Therefore，allergenomics was proposed.In this paper，the conception，the research technique and the application of allergenomics on food allergy were briefly reviewed.

allergenomics；allergen；food allergy

TS201.6

A

1002-0306（2014）14-0381-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.075

2013－10－28 *通訊聯系人

佟平（1984-），女，助理研究員，研究方向：食品營養與安全。

國家高技術研究發展計劃（863計劃）（2013AA102205）；國家自然科學基金（31171716，31301524）；高等學校博士學科點專項科研基金資助課題（20113601110003）；國家國際科技合作專項資助（2013DFG31380）；江西省自然科學基金重點項目（20133ACB2009）；江西省科技計劃項目（20122BBG70170-2）。