HPLC法測定膽酸類化合物與牛血清白蛋白的結合率Δ

張曉靜，李丹丹，張俊義，孫毅坤（.北京中醫藥大學中藥學院，北京0002；2.北京中醫藥大學，北京0002）

膽汁酸在脂類物質的消化吸收和膽固醇代謝方面發揮著重要作用，膽酸（CA）作為人體膽汁中含量最豐富的膽汁酸，主要用作利膽藥，因可治療膽囊炎、膽汁缺乏、腸道消化不良等癥而被廣泛使用[1-2]。目前市場上已有膽酸鈉片、豬脫氧膽酸（HDCA）片等膽酸類藥物。藥物作用的強弱與作用部位的藥物濃度密切相關，當藥物在體內各組織分布趨于動態平衡時，組織內藥物化學勢趨于一致，其轉運速率遵循一定的規律。然而，血液中的藥物有相當一部分可與蛋白結合，而結合形態的藥物不能夠參加轉運并發揮藥理作用；但結合態藥物與游離態藥物之間存在一個動態平衡，隨著藥物在體內代謝、排泄或組織內蓄積，與蛋白結合的藥物可解離為游離態藥物，在一定程度上達到維持血藥濃度的作用[3-4]。因此，藥物與蛋白的結合作用對于藥物體內過程的研究有著重要的意義。近年來有關膽酸類化合物研究的文獻報道很多[5-7]，但是針對膽酸類化合物與蛋白之間的相互作用卻鮮有研究，而了解二者的相互作用有助于從分子水平上進一步了解膽酸類化合物體內蛋白結合特性，從而有助于設計和改造膽酸類藥物分子以提高藥效和安全性，縮短作用時間，進而為膽酸類化合物的藥效學、藥動學、藥理學以及毒理學方面提供重要依據和參考。本試驗采用平衡透析法研究了膽酸類化合物與牛血清白蛋白（BSA）的結合率，為進一步開展膽酸類的相關研究提供依據。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；Alltech3300-蒸發光散射檢測（ELSD）器（北京先明樂施科技發展有限公司）；TGL-16G高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；VORTEX GENIVS 3旋渦混勻儀[萊貝（上海）科學儀器有限公司]；MTN-2800D型氮氣吹干儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；DSHZ-300多用途水浴恒溫振蕩器（江蘇太倉市實驗設備廠）；pHS-W型精密pH計（上海般特儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

膽酸對照品、豬脫氧膽酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100078-200414、100087-200610，均為含量測定用）；BSA標準品（北京拜爾迪生物技術有限公司，批號：C020102，純度：98%）；透析袋（北京拜爾迪生物技術有限公司）；甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對照品貯備液：分別精密稱取膽酸對照品、豬脫氧膽酸對照品適量，置于10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得膽酸、豬脫氧膽酸的對照品貯備液，備用。

2.1.2 BSA溶液：取BSA標準品適量，精密稱定，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）溶解并稀釋至刻度，制成濃度為1 mmol/L的BSA溶液。

2.1.3 透析液：取磷酸二氫鉀2.72 g、氯化鈉8.8 g，加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液適量，調節pH至7.4，補水至1000 ml，即得濃度為0.02 mol/L的PBS（內含0.15 mol/L氯化鈉），作為透析液。

2.2 色譜條件

色譜柱：Thermo-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.1%甲酸溶液（80∶20），流速：1.0 ml/min；進樣量：15 μl；ELSD檢測器；漂移管溫度：80℃；氣體流速：2.0 L/min。分別進樣膽酸的PBS溶液、膽酸的BSA溶液、透析袋內膽酸樣品溶液、透析袋外膽酸樣品溶液、豬脫氧膽酸的PBS溶液、豬脫氧膽酸的BSA溶液、透析袋內豬脫氧膽酸樣品溶液、透析袋外豬脫氧膽酸樣品溶液和透析液，記錄色譜，見圖1。

圖1 膽酸類化合物的HPLC圖A.膽酸的PBS溶液；B.膽酸的BSA溶液；C.透析袋內膽酸樣品溶液；D.透析袋外膽酸樣品溶液；E.豬脫氧膽酸的PBS溶液；F.豬脫氧膽酸的BSA溶液；G.透析袋內豬脫氧膽酸樣品溶液；H.透析袋外豬脫氧膽酸樣品溶液；I.透析液；1.膽酸；2.豬脫氧膽酸Fig 1 HPLC chromatograms of cholic acid compoundsA.PBS solution of CA；B.BSA solution of CA；C.sample solution of CA in dialysis bag；D.sample solution of CA out of dialysis bag；E.PBS solution of HDCA；F.BSA solution of HDCA；G.sample solution of HDCA in dialysis bag；H.sample solution of HDCA out of dialysis bag；I.dialysate；1.CA；2.HDCA

由圖1可知，本試驗中膽酸、豬脫氧膽酸的PBS溶液及BSA溶液的色譜圖峰形良好，無雜質干擾測定，具有較高的特異性，分析條件可行。

2.3 樣品處理

取樣品溶液200 μl，加入0.1 mol/L 鹽酸溶液50 μl，加甲醇1 ml沉淀蛋白，旋渦混合30 s，以12000 r/min（離心半徑：8 cm）離心5 min，取上清液500 μl置于另一干燥聚乙烯塑料（PE）管中，氮氣吹干，加200 μl甲醇復溶，即得。

2.4 線性關系考察

2.4.1 膽酸、豬脫氧膽酸在BSA溶液中的標準曲線：取膽酸對照品貯備液適量，用甲醇稀釋成0.26、0.52、1.03、2.05、4.1 mg/ml系列對照品溶液；另取豬脫氧膽酸對照品貯備液適量，用甲醇稀釋成0.30、0.59、1.18、2.36、4.72 mg/ml系列對照品溶液；再分別取200 μl BSA溶液各5份，分別加入上述不同質量濃度的膽酸、豬脫氧膽酸系列對照品溶液各100 μl，分別配成相當于含0.029、0.058、0.116、0.232、0.464 mg/ml膽酸及 0.019、0.039、0.078、0.156、0.311 mg/ml豬脫氧膽酸的蛋白樣品，按“2.3”項下方法處理后，進樣分析，記錄峰面積。以對照品質量濃度的對數值（x）為橫坐標、峰面積的對數值（y）為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為：膽酸y＝0.9862x+3.8111（r＝0.9997），豬脫氧膽酸y＝1.0806x+4.0587（r＝0.9997）。結果二者檢測質量濃度的線性范圍分別為：膽酸0.029～0.464 mg/ml、豬脫氧膽酸0.019～0.311 mg/ml。

2.4.2 膽酸、豬脫氧膽酸在透析液中的標準曲線：分別取200 μl空白PBS各5份，加入“2.4.1”項下膽酸、豬脫氧膽酸系列對照品溶液各100 μl，分別配制成相當于含0.029、0.058、0.116、0.232、0.464 mg/ml膽酸及 0.019、0.039、0.078、0.156、0.311 mg/ml豬脫氧膽酸的透析液樣品，按“2.3”項下方法處理后，進樣分析，記錄峰面積。以對照品質量濃度的對數值（x）為橫坐標、峰面積的對數值（y）為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為：膽酸y＝1.1227x+3.8697（r＝0.9997）、豬脫氧膽酸y＝1.15x+4.204（r＝0.9998）。結果二者檢測質量濃度的線性范圍分別為：膽酸0.029～0.464 mg/ml、豬脫氧膽酸0.019～0.311 mg/ml。

2.5 回收率試驗

分別在BSA溶液、透析液中加入質量濃度分別為膽酸0.51、1.025、2.05 mg/ml及豬脫氧膽酸0.59、1.18、2.36 mg/ml的對照品溶液，每種質量濃度平行6份，進樣分析，計算回收率。結果3種質量濃度BSA溶液中膽酸的回收率分別為98.7%、97.7%、101.4%，RSD分別為2.7%、4.4%、1.6%（n＝6）；3種質量濃度透析液中膽酸的回收率分別為104.8%、99.7%、101.6%，RSD分別為0.6%、4.6%、1.6%（n＝6）。在3種質量濃度BSA溶液中豬脫氧膽酸的回收率分別為98.8%、103.2%、99.9%，RSD分別為3.5%、1.3%、3.5%（n＝6）；3種質量濃度透析液中豬脫氧膽酸的回收率分別為99.5%、101.3%、99.8%，RSD分別為3.8%、4.07%、5.4%（n＝6）。

2.6 精密度試驗

2.6.1 日內精密度：取“2.4”項下含0.058、0.116、0.232 mg/ml膽酸及0.039、0.078、0.156 mg/ml豬脫氧膽酸的蛋白樣品和透析液樣品，每個樣品同日內進樣5次，考察日內精密度。結果膽酸在3種質量濃度蛋白樣品中的RSD分別為1.66%、0.89%、1.07%（n＝5），在3種質量濃度透析液樣品中的RSD分別為1.70%、1.84%、1.68%（n＝5）；豬脫氧膽酸在3種質量濃度蛋白樣品中的RSD分別為0.06%、0.5%、0.5%（n＝5），在3種質量濃度透析液樣品中的RSD分別為0.2%、0.4%、1.0%（n＝5）。

2.6.2 日間精密度：取“2.4”項下含0.058、0.116、0.232 mg/ml膽酸及0.039、0.078、0.156 mg/ml豬脫氧膽酸的蛋白樣品和透析液樣品，每日進樣測定5次，連續測定3 d，考察日間精密度。結果膽酸在3種質量濃度蛋白樣品中的RSD分別為1.51%、1.85%、1.92%（n＝3），在3種質量濃度透析液樣品中的RSD分別為1.94%、1.82%、1.80%（n＝3）；豬脫氧膽酸在3種質量濃度蛋白樣品中的RSD分別為1.7%、4.1%、3.9%（n＝3），在3種質量濃度透析液樣品中的RSD分別為2.2%、3.2%、4.2%（n＝3）。

2.7 穩定性試驗

分別在BSA溶液、透析液中加入質量濃度為0.51、1.025、2.05 mg/ml膽酸及0.59、1.18、2.36 mg/ml豬脫氧膽酸的對照品溶液，制成蛋白樣品和透析液樣品，按“2.3”項下方法處理后，室溫下保存，分別于0、2、6、10、16、30 h 進樣分析，記錄峰面積。結果膽酸在3種質量濃度蛋白樣品中的RSD分別為0.74%、0.61%、0.78%（n＝6），在3種質量濃度透析液樣品中的RSD分別為0.64%、0.61%、0.32%（n＝6）；豬脫氧膽酸在3種質量濃度蛋白樣品中的RSD分別為1.8%、1.2%、3.9%（n＝6），在3種質量濃度透析液樣品中的RSD分別為1.5%、1.1%、3.3%（n＝6）。表明樣品在室溫下放置30 h內穩定。

2.8 蛋白結合率的測定[8-9]

將管狀透析袋一端用線結扎使不漏液，用移液管精密量取BSA溶液1 ml加入透析袋中，另一端折疊并用線結扎袋口，袋內保留少量空氣，使透析袋能懸浮在透析液中。將透析袋置于盛有10 ml透析液的廣口瓶中，調節袋內外液面高度，使保持同一水平。分別加入膽酸、豬脫氧膽酸對照品溶液適量，使透析外液的質量濃度均分別為0.51、1.01、2.02 mg/ml，最后用封口膜封住瓶口，每種質量濃度平行3份。于37℃恒溫震蕩30 h，到達平衡時間后，吸出袋外少量透析液，加等量10%高氯酸溶液，檢查有無蛋白漏出。若袋外透析液變渾濁，則作廢。取出透析袋，用濾紙吸干附著于袋外壁上的透析液，分別精密吸取袋內BSA溶液100 μl、袋外透析液100 μl作為蛋白樣品，按“2.3”項下方法處理后，進樣測定。按公式計算蛋白結合率，蛋白結合率＝（袋內藥物質量濃度－袋外藥物質量濃度）/袋內藥物質量濃度×100%，結果見表1。

表1 膽酸、豬脫氧膽酸與BSA的結合率測定結果Tab 1 Binding rate results of CA or HDCA with bovine serum albumin

2.9 平衡時間的確定

在透析袋內以1 ml透析液代替BSA溶液，透析袋外液中膽酸、豬脫氧膽酸的質量濃度分別為2.02、1.01、0.51 mg/ml，在9、18、30 h時測定二者在透析袋內、外的質量濃度，以二者質量濃度比值確定藥物從袋內、外自由擴散達到平衡的時間。結果30 h時袋內、外溶液中藥物的質量濃度基本相等，表明擴散30 h已達到平衡，因此設定平衡透析時間為30 h。平衡時間的考察結果見表2。

2.10 藥物在透析膜上的吸附

將透析袋內加入1 ml空白PBS，在透析袋外加入10 ml PBS及質量濃度為5.56、11.11、22.22 mg/ml的膽酸溶液或豬脫氧膽酸溶液各1 ml，每種質量濃度平行3份，當藥物達到平衡后，測定透析袋外藥物濃度。根據參考文獻[10]計算3種質量濃度的膽酸、豬脫氧膽酸在透析膜上的吸附率分別為5.04%、3.54%、1.89%及6.53%、7.43%、5.04%，表明透析袋對膽酸及豬脫氧膽酸雖有微弱的吸附，該吸附量可忽略不計。

表2 平衡時間的考察結果（n＝3）Tab 2Results of equilibrium time（n＝3）

3 討論

平衡透析法的平衡溫度一般可選在37℃或4℃恒溫條件下測定。本試驗采用37℃為溫育溫度以模擬正常人體體溫。本試驗中采用截留相對分子質量為3500的透析膜進行試驗，由高效液相色譜圖可知，與透析液比較，透析袋外液的樣品圖譜基線較平穩，無明顯雜質峰，表明蛋白中并無大量內源性物質從透析袋中滲出。此外，透析袋對藥物的吸附微量，不影響測定結果，表明采用該型號的透析袋以平衡透析法測定膽酸類化合物的蛋白結合率是可行的。

本研究結果顯示，高效液相色譜法測定膽酸與BSA結合率試驗具有簡便、快速、靈敏與選擇性高的特點；且膽酸、豬脫氧膽酸與BSA具有中等強度的蛋白結合率，即為膽酸類小分子在體內被蛋白儲存和轉運提供條件的同時，膽酸類化合物在體內不易因游離濃度過大而產生副作用；在試驗濃度范圍內，蛋白結合率與透析液的藥物濃度無關，同時，二者與蛋白的結合率沒有明顯差異。

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