HPLC法測定1，2-環(huán)己烷二甲醇中非對映異構(gòu)體的含量

郭文敏，李清娟，張 琪，陳素銳，邢 浩[.石藥集團中奇制藥技術(shù)（石家莊）有限公司，石家莊 050035；.石家莊職業(yè)技術(shù)學(xué)院，石家莊 05008]

鹽酸魯拉西酮（Lurasidone hydrochloride，商品名為Latuda）是第2代抗精神分裂癥新藥，于2010年10月28日被美國FDA批準上市，用于成人的精神分裂癥。其作為一種具有雙重作用的抗精神分裂癥治療藥物[1-3]，同時作用于多巴胺D2受體、5-羥色胺（5-HT）7受體、5-HT1a受體、5-HT2a受體、α2c-腎上腺素受體，除可抑制注意缺陷多動障礙外，還可有效抑制5-HT2受體介導(dǎo)的行為，可劑量依賴性地顯著抑制緩解條件性恐懼應(yīng)急所致的僵滯行為。1，2-環(huán)己烷二甲醇（以下簡稱環(huán)己烷二甲醇）是鹽酸魯拉西酮合成中的關(guān)鍵起始原料，在合成反應(yīng)中，環(huán)己烷二甲醇中的非對映異構(gòu)體也參與反應(yīng)，生成鹽酸魯拉西酮的異構(gòu)體雜質(zhì)，但在工藝中除去較為困難，因此嚴格控制環(huán)己烷二甲醇中非對映異構(gòu)體的含量是合成中的一個關(guān)鍵控制點，但目前關(guān)于環(huán)己烷二甲醇中非對映異構(gòu)體的檢測方法尚未見文獻報道。筆者建立了采用示差折光檢測器[4-7]測定環(huán)己烷二甲醇中非對映異構(gòu)體雜質(zhì)的高效液相色譜（HPLC）方法，結(jié)果表明建立的方法準確、快速，為有效控制終產(chǎn)品鹽酸魯拉西酮中的光學(xué)異構(gòu)體雜質(zhì)提供了方法，為該產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供了保障。

1 材料

1.1 儀器

e2695 HPLC儀、2414示差折光檢測器（美國Waters公司）。

1.2 藥品與試劑

環(huán)己烷二甲醇對照品（批號：20120901，純度：99.85%）、環(huán)己烷二甲醇非對映異構(gòu)體對照品（批號：20120902，純度：99.69%）、環(huán)己烷二甲醇原料藥（批號：20120301、2012302、2012303，純度：99.76%、99.71%、99.79%）均由石藥集團中奇制藥技術(shù)（石家莊）有限公司提供；甲醇為色譜純，甲酸銨為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與檢測器條件

色譜柱：Agilent Rx C8（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：0.01 mol/L甲酸銨緩沖溶液（pH 3.0）-甲醇（70∶30），流速：1.0 ml/min；進樣量：20 μl；柱溫：35 ℃；檢測器內(nèi)部溫度：35 ℃，外部溫度：35 ℃；采樣速率：2.50 μl/s，過濾時間常數(shù)：1.0 s；極性：+；靈敏度：1250.0 nRIU/mV。

2.2 供試品溶液制備

精密稱取原料藥約100 mg，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.3 對照品溶液制備

精密稱取環(huán)己烷二甲醇與環(huán)己烷二甲醇非對映異構(gòu)體對照品各適量，分別置于10 ml量瓶中，加流動相溶解制成含環(huán)己烷二甲醇約為10 mg/ml、環(huán)己烷二甲醇非對映異構(gòu)體0.01 mg/ml的溶液，搖勻，濾過，即得。

2.4 專屬性考察

分別精密稱取環(huán)己烷二甲醇與環(huán)己烷二甲醇非對映異構(gòu)體對照品適量，加流動相溶解分別制成各自的對照品溶液及2種對照品的混合對照品溶液。依次精密吸取上述3種溶液及供試品溶液各20μl注入色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明，環(huán)己烷二甲醇峰與其非對映異構(gòu)體峰的保留時間分別約為11、8 min，2個色譜峰之間分離度大于2.0，理論板數(shù)均高于5000，色譜圖見圖1。

2.5 線性關(guān)系與響應(yīng)因子考察

圖1 高效液相色譜圖A.環(huán)己烷二甲醇對照品；B.環(huán)己烷二甲醇非對映異構(gòu)體對照品；C.供試品；D.混合對照品；1.環(huán)己烷二甲醇；2.環(huán)己烷二甲醇非對映異構(gòu)體Fig 1 HPLC chromatogramsA.cyclohexanedimethanol control；B.cyclohexanedimethanol diastereoisomer control；C.test sample；D.mixed control；1.cyclohexanedimethanol；2.cyclohexanedimethanol diastereoisomer

分別精密稱取環(huán)己烷二甲醇對照品和環(huán)己烷二甲醇非對映異構(gòu)體對照品適量，加流動相溶解并稀釋制成含環(huán)己烷二甲醇分別為0.01、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/ml與非對映異構(gòu)體分別為10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 μg/ml的對照品溶液；分別精密吸取20μl，注入色譜儀，記錄峰面積，以質(zhì)量濃度（c）為橫坐標(biāo)、峰面積（A）為縱坐標(biāo)，進行線性回歸，得環(huán)己烷二甲醇及其非對映異構(gòu)體的線性方程分別為：A＝2985.5c+12.9（r＝0.9999，n＝6）、A＝2981.1c+9.5（r＝0.9999，n＝5）。結(jié)果表明，環(huán)己烷二甲醇及其非對映異構(gòu)體檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.01～10.0 mg/ml、10.0～200.0 μg/ml；且以環(huán)己烷二甲醇響應(yīng)因子為1計，環(huán)己烷二甲醇非對映異構(gòu)體的相對響應(yīng)因子為0.996。

2.6 精密度試驗

分別精密吸取環(huán)己烷二甲醇（10.0 mg/ml）及其非對映異構(gòu)體（100.0 μg/ml）的對照品溶液20 μl，重復(fù)進樣5次，測得二者峰面積的RSD分別為0.42%、0.44%（n＝5），表明方法精密度良好。

2.7 檢測限與定量限試驗

采用逐級稀釋的方法制備系列質(zhì)量濃度的環(huán)己烷二甲醇非對映異構(gòu)體對照品溶液，進樣測定。當(dāng)信噪比≥10時，環(huán)己烷二甲醇非對映異構(gòu)體的定量限為31 ng；當(dāng)信噪比≥3時，環(huán)己烷二甲醇非對映異構(gòu)體的檢測限為10 ng。

2.8 重復(fù)性試驗

取樣品（批號：20120301）共5份，分別制備成供試品溶液，進樣測定，結(jié)果樣品中環(huán)己烷二甲醇和非對映異構(gòu)體雜質(zhì)的含量分別為99.76%、0.24%，RSD分別為1.39%、1.96%（n＝5）。

2.9 回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品（批號：20120301，環(huán)己烷二甲醇及其非對映異構(gòu)體的含量分別為99.76%、0.24%）約100 mg各9份；于9份樣品中依次精密加入環(huán)己烷二甲醇非對映異構(gòu)體對照品溶液（0.3040 mg/ml）0.4、0.8、1.2 ml各3份，并制備成供試品溶液。分別精密吸取20μl，注入色譜儀，記錄色譜圖，計算回收率，結(jié)果見表1。

2.10 溶液穩(wěn)定性考察

取“2.8”項下供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h時精密吸取20μl，注入色譜儀，記錄色譜圖，測定其峰面積。結(jié)果環(huán)己烷二甲醇及其非對映異構(gòu)體峰面積的RSD分別為0.65%、0.69%（n＝6）。結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

表1 回收率試驗結(jié)果（n＝3）Tab 1Results of recovery test（n＝3）

2.11 耐用性考察

依據(jù)2010年版《中國藥典》（二部）附錄ⅪⅩA關(guān)于藥品質(zhì)量標(biāo)準分析方法驗證指導(dǎo)原則[8]，以主峰理論板數(shù)、主峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度為評價指標(biāo)，分別選用以辛烷基硅烷鍵合硅膠為固定相、不同品牌的色譜柱（柱1：Agilent；柱2：Waters；柱3：Phenomenex），不同pH（2.9、3.0、3.1）的0.01 mol/L甲酸銨緩沖溶液，不同流動相比例，不同流速，不同柱溫進行方法優(yōu)化，最終確定了本試驗的最佳分離分析條件即“2.1.1”項下條件。具體試驗結(jié)果見表2。

表2 方法耐用性考察結(jié)果Tab 2 Results of robustness test

2.12 樣品含量測定

取3批樣品制備成供試品溶液后進樣測定，計算樣品中環(huán)己烷二甲醇非對映異構(gòu)體雜質(zhì)的含量，結(jié)果分別為0.19%、0.27%、0.21%。

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

由于環(huán)己烷二甲醇與其非對映異構(gòu)體為極性較為相似的化合物，前期試驗中分別采用以辛烷基硅烷鍵合硅膠、十八烷基硅烷鍵合硅膠、氨基鍵合硅膠為填料的色譜柱進行分析。結(jié)果表明，采用辛烷基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱，環(huán)己烷二甲醇與其非對映異構(gòu)體的色譜峰峰形良好、柱效最佳；經(jīng)考察不同品牌的辛烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱，結(jié)果表明均符合要求，本文擬定方法良好。

3.2 流動相組成的優(yōu)化

由于示差折光檢測器屬于光學(xué)檢測器，流動相中存在的微小氣泡會使基線不穩(wěn)，甚至影響檢測，因此流動相在臨用前應(yīng)將緩沖溶液與有機相按比例混為一相、進行脫氣后方可使用。因此本測定方法中的流動相組成是首先借助蒸發(fā)光散射檢測器進行優(yōu)化確定后，再采用示差折光檢測器進行方法學(xué)驗證研究。在選用流動相體系時，使用甲酸銨緩沖溶液，調(diào)pH為3.0，可使二者的分離度與峰形達到最佳；在有機相的選擇過程中，經(jīng)試驗篩選使用甲醇更優(yōu)，且可調(diào)空間較大。

3.3 其他應(yīng)用

本方法除可用于測定環(huán)己烷二甲醇中的非對映異構(gòu)體雜質(zhì)外，亦可用于環(huán)己烷二甲醇及其非對映異構(gòu)體的含量測定。

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