補中益氣丸補氣療效的譜-效關系研究Δ

胡芳，楊英來，劉小花，朱瑞娟，李燦，封士蘭（蘭州大學藥學院，蘭州730000）

補中益氣丸是臨床常用中成藥，由君藥黃芪，臣藥黨參、甘草（蜜炙）、白術（炒），佐藥當歸、升麻，使藥柴胡、陳皮組成，具有補中益氣、升陽舉陷之功能[1]，在臨床上尚有健脾化濕、升清降濁等作用[2]。該方組方嚴謹，用藥精良，其中“益氣升陽”配伍是該方的一大特色[3]。

中藥復方制劑化學成分復雜[4]，其藥理作用是各味藥材中多種有效成分的綜合作用[5]。目前有關補中益氣丸的研究多數集中于含量測定[6-7]以及指紋圖譜[8-9]的研究上，但指紋圖譜與補氣作用的譜-效相關性研究未見文獻報道。筆者同時建立了補中益氣丸的高效液相色譜（HPLC）-二極管陣列檢測器（DAD）和HPLC-蒸發光散射檢測器（ELSD）指紋圖譜，將兩者分別與其補氣作用進行了譜-效關聯度分析，全面評價了補中益氣丸的質量。

1 材料

1.1 儀器

2695型HPLC儀，包括2996型DAD、Millenium32型色譜管理站、Oasis HLB 3cc型固相萃取（SPE）小柱（美國Waters公司）；ALTCH 2000型蒸發光散射檢測器（ELSD，美國奧泰公司）；KQ-400DE型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；UV1700型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；BP211D型十萬分之一天平、BS224S型萬分之一天平（德國賽多利斯公司）；MIKRO 22型離心機（德國Hettich公司）；1.0版中藥色譜指紋圖譜計算機輔助相似性評價系統軟件（中南大學）。

1.2 藥品與試劑

補中益氣丸[蘭州太寶制藥有限公司，批號：83111110（A）、83111213（B）、83121124（C）、83121003（D）、83120875（E）；蘭州佛慈制藥股份有限公司，批號：12J52（F）、12F39（G）、12J50（H）、12F40（I）、12J49（J）]；毛蕊異黃酮（批號：111530）、黃芪甲苷（批號：110781）、橙皮苷（批號：721）、洋川芎內酯Ⅰ（批號：12062722）對照品均購自上海一林生物科技有限公司（純度均＞98%）；藁本內酯（批號：110612-20013700）、芒柄花素（批號：110714-200501）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為分析純，乙腈為色譜純，水為超純水。

1.3 動物

KM種小鼠120只，♀♂兼用，體質量18～22 g，由蘭州大學動物實驗中心提供[實驗動物使用合格證號：SCXK（甘）2009-0004]。

2 方法

2.1 補中益氣丸補氣作用研究

對小鼠控制飲食（喂食量為平時的1/2），并進行力竭游泳，游泳水溫控制在25℃，不能以尾撐桶邊休息，每天1次，連續14 d[10]，以復制小鼠力竭模型。力竭標準為游泳最后下沉，經10 s后仍不能返回水面[11]。120只小鼠隨機均分為12組，即正常對照（等容生理鹽水）組、模型（等容生理鹽水）組與補中益氣丸①、②、③、④、⑤、⑥、⑦、⑧、⑨、⑩（A、B、C、D、E、F、G、H、I、J，1.06 g/kg）組。復制模型成功后ig給藥，每天1次，連續10 d。末次給藥后0.5 h，尾iv20%印度墨汁0.01 ml/g，于iv后2 min（t1）、10 min（t2），分別從眼靜脈叢取血 20 μl，溶于 2 ml 0.1%NaHCO3溶液中，搖勻，用分光光度計在600 nm波長處測定吸光度（A）。將小鼠脫臼處死，分別稱肝、脾和胸腺質量，按下式計算胸腺或脾臟指數：

胸腺或脾臟指數＝胸腺或脾臟濕質量（mg）/體質量（g）

再按下式計算廓清指數（K）或校正廓清指數（α，表示吞噬活性）：

K＝（lgA1－lg A2）（/t2－t1），α＝體質量（/肝質量+脾質量）[12]

2.2 補中益氣丸指紋圖譜研究

2.2.1 溶液的制備 （1）供試品溶液的制備：稱取補中益氣丸粉末2.5 g，置100 ml錐形瓶中，加60 ml甲醇浸泡，超聲30 min，濾過，殘渣加40 ml甲醇，超聲30 min，濾過。合并濾液，蒸干，加3 ml水溶解，以離心半徑為8.69 cm、10000 r/min離心6 min，取上清液用SPE小柱純化[13-14]（SPE小柱預先用7.5 ml甲醇和7.5 ml水活化），分別用1.0 ml水、1.0 ml 10%甲醇、1.0 ml 90%甲醇洗脫，收集10%甲醇和90%甲醇的洗脫液，混合，氮吹，加甲醇定容至2 ml，0.45μm微孔濾膜濾過，續濾液即為供試品溶液。（2）對照品溶液的制備：精密稱取橙皮苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、洋川芎內酯Ⅰ、藁本內酯、黃芪甲苷對照品各適量，置10 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，得橙皮苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、洋川芎內酯Ⅰ、藁本內酯、黃芪甲苷質量濃度分別為0.135、0.210、0.144、0.180、0.164、0.186 mg/ml的對照品溶液。

2.2.2 色譜條件色譜柱：思博爾ODS-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（程序見表1）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：290 nm；柱溫：30℃；漂移管溫度：110.5 ℃；載氣流速：3.1 ml/min；進樣量：30 μl。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab 1 Gradient program procedure of mobile phase

2.2.3 供試品測定 按“2.2.1”項下方法平行制備10批樣品的供試品溶液，分別精密吸取各供試品溶液30 μl，注入HPLC儀，按“2.2.2”項下色譜條件測定，記錄80 min色譜圖。

2.3 補中益氣丸指紋圖譜與藥效作用灰關聯度分析

灰關聯度分析來自灰色系統理論，具有整體性的特點。如果兩個因素同步變化程度較高，則兩者關聯度大；反之，兩者關聯度小。選取α作為藥效參數，對補中益氣丸HPLC-DAD和HPLC-ELSD指紋圖譜與補氣療效進行灰關聯度分析。

3 結果

3.1 補中益氣丸的補氣作用

與正常對照組比較，模型組小鼠體質量增加，胸腺指數、脾指數、K、α減小，差異具有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，補中益氣丸①、③、④、⑥、⑧、⑨、⑩組小鼠體質量增加，胸腺指數、脾指數、K、α增加，差異具有統計學意義（P＜0.01或P＜0.05）；補中益氣丸⑤、⑦組小鼠體質量增加，脾指數、K、α增加，差異具有統計學意義（P＜0.01或P＜0.05）；補中益氣丸②組小鼠體質量增加，胸腺指數、K、α增加，差異具有統計學意義（P＜0.01或P＜0.05）。補中益氣丸對模型小鼠體質量、臟器指數的影響見表2；對K、α的影響見表3。

表2 補中益氣丸對模型小鼠體質量、臟器指數的影響（±s，n＝10）Tab 2 Influence of Buzhong yiqi pills on body weight and viscera index of model mic（e±s，n＝10）

表2 補中益氣丸對模型小鼠體質量、臟器指數的影響（±s，n＝10）Tab 2 Influence of Buzhong yiqi pills on body weight and viscera index of model mic（e±s，n＝10）

與正常對照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.normal control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常對照組模型組補中益氣丸①組補中益氣丸②組補中益氣丸③組補中益氣丸④組補中益氣丸⑤組補中益氣丸⑥組補中益氣丸⑦組補中益氣丸⑧組補中益氣丸⑨組補中益氣丸⑩組脾指數3.58±0.312.60±0.41＊3.36±0.43##3.14±0.513.41±0.37##3.46±0.30##3.30±0.56#3.53±0.65##3.45±0.36##3.50±0.43##3.51±0.54##3.44±0.85#體質量增加值/g 0.96±0.218.68±1.53＊11.00±1.90#10.71±1.45#12.11±0.96##11.34±2.13#12.59±1.86##11.59±1.92##11.64±1.71##12.64±1.88##12.15±1.97##12.48±1.48##胸腺指數3.18±1.871.28±0.28＊2.85±0.52##2.32±0.52##2.27±0.97#2.56±0.80##2.13±0.912.65±0.91##2.16±1.032.42±0.63##2.31±0.58##2.18±0.71##

表3 補中益氣丸對模型小鼠K、α的影響（±s，n＝10）Tab 3 Influence of Buzhong yiqi pills on clearance index and correct clearance index of model mic（e±s，n＝10）

表3 補中益氣丸對模型小鼠K、α的影響（±s，n＝10）Tab 3 Influence of Buzhong yiqi pills on clearance index and correct clearance index of model mic（e±s，n＝10）

與正常對照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.normal control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常對照組模型組補中益氣丸①組補中益氣丸②組補中益氣丸③組補中益氣丸④組補中益氣丸⑤組補中益氣丸⑥組補中益氣丸⑦組補中益氣丸⑧組補中益氣丸⑨組補中益氣丸⑩組K α 6.3195±0.78044.0610±0.3826＊6.1147±1.3120##5.3451±1.0688#5.2476±0.7544##5.4170±1.1679##5.9625±1.0063##5.2836±1.0011#5.4412±1.1041#6.0132±1.1108##5.0455±0.7059##5.0843±0.7176##0.0427±0.01770.0160±0.0039＊0.0428±0.0224##0.0282±0.0109#0.0286±0.0113#0.0319±0.0192#0.0386±0.0187#0.0358±0.0145##0.0390±0.0212##0.0401±0.0216##0.0241±0.0084#0.0227±0.0064#

3.2 補中益氣丸指紋圖譜的建立

HPLC-DAD指紋圖譜中有21個峰是各供試品所共有的，因此確定這21個峰為共有峰。與對照品的保留時間和紫外數據進行對比，確定11、12、18、19、21號峰分別為橙皮苷、洋川芎內酯Ⅰ、毛蕊異黃酮、芒柄花素、藁本內酯。HPLC-ELSD指紋圖譜中有10個峰是各供試品所共有的，其中4、8號峰與對照品橙皮苷、黃芪甲苷的保留時間一致，確定其分別為橙皮苷、黃芪甲苷。10批補中益氣丸的HPLC-DAD、HPLC-ELSD指紋圖譜分別見圖1、圖2（圖中R為共有模式）。

圖1 10批補中益氣丸的HPLC-DAD指紋圖譜Fig 1 HPLC-DAD fingerprint for 10 batches of Buzhong yiqi pills

圖2 10批補中益氣丸的HPLC-ELSD指紋圖譜Fig 2 HPLC-ELSD fingerprint for 10 batches of Buzhong yiqi pills

3.3 灰關聯度分析

對補中益氣丸HPLC-DAD指紋圖譜與補氣療效進行灰關聯度分析，依據關聯度的大小（見表4），確定了各成分（以特征峰編號作為該特征峰所代表的化學成分名稱）對補氣作用貢獻的大小順序為：7＞8＞6＞11＞4＞9＞19＞14＞1＞16＞3＞13＞15＞18＞12＞5＞17＞2＞21＞10＞20。對補中益氣丸HPLC-ELSD指紋圖譜與補氣療效進行灰關聯度分析，依據關聯度的大小（見表5），確定了各成分（以特征峰編號作為該特征峰所代表的化學成分名稱）對補氣作用貢獻的大小順序為：1＞6＞4＞2＞9＞5＞10＞3＞8＞7。研究結果表明，HPLCDAD與HPLC-ELSD指紋圖譜中各峰所代表的化學成分與補氣作用均有一定的關聯（關聯度＞0.62），表明補中益氣丸的補氣作用均是其所有化學成分共同作用的結果。本研究確認的已知成分中橙皮苷和芒柄花素與補氣作用具有較高關聯（關聯度＞0.78）。

4 討論

由于單一復制模型方法不能達到滿意的效果，筆者采用限制食量和游泳使其疲勞的聯合方法復制小鼠氣虛模型。復制模型結束后小鼠精神萎靡、毛發稀疏蓬松、尾爪顏色蒼白、弓背趴地、活動明顯減少且反應遲鈍，證明復制模型成功。給藥后各給藥組小鼠精神狀態得到不同程度改善，活動量增大，皮毛光澤，而模型組無明顯變化，證明10批補中益氣丸對氣虛癥狀均有改善作用。

補中益氣丸成分復雜，制劑過程中加入了潤濕劑、黏合劑等輔料，干擾雜質較多，色譜圖峰形不好。有些化合物不可逆地吸附于色譜柱，導致色譜柱柱效降低、實驗重復性差。SPE小柱應用于補中益氣丸HPLC供試品溶液的前處理，減少了雜質，獲得了理想的色譜，提高了實驗可重復性，保證了各樣品分析壞境的一致。

表4 10批補中益氣丸HPLC-DAD指紋圖譜的共有峰與補氣療效之間的關聯系數和關聯度Tab 4 The correlation coefficient and correlation degree between tonifying qi efficacy and the common peak of HPLCDAD fingerprint for 10 batches of Buzhong yiqi pills

表5 10批補中益氣丸HPLC-ELSD指紋圖譜的共有峰與補氣療效之間的關聯系數和關聯度Tab 5 The correlation coefficient and correlation degree between tonifying qi efficacy and the common peak area of HPLC-ELSD fingerprint for 10 batches of Buzhong yiqi pills

筆者選取K和α作為藥效學指標，K反映了機體單核-巨噬細胞系統吞噬細胞的能力，α考慮了個體體質量和臟器質量對吞噬能力的影響，消除了一定的個體誤差。結果顯示，補中益氣丸各組較模型組均能不同程度地提高K和α。指紋圖譜與藥效數據的相關性分析顯示，HPLC-DAD指紋圖譜和HPLC-ELSD指紋圖譜均與補中益氣丸的補氣作用有一定對應關系。根據關聯度大小，可得出結論：補中益氣丸中對補氣作用貢獻較大的成分有橙皮苷、芒柄花素，更多成分有待進一步研究。

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