Box-Behnken設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選四逆泡騰片干法制粒工藝Δ

傅亮，余曉耕，譚和平，盧慶紅，雷光遠，姜穎，羅曉健#（.江西省兒童醫(yī)院，南昌330006；.江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，南昌 330006）

四逆泡騰片為經(jīng)典名方四逆湯的改劑型制劑，由附子、干姜、甘草3味藥材組成，為回陽救逆的代表方，臨床療效確切[1]。由于原煎劑存在攜帶、服用不便，易染菌等缺點，筆者將其制備成泡騰片，具有使用方便、釋藥速度快等優(yōu)勢[2]。泡騰片中酸堿輔料共存于同一制劑，如采用濕法制粒，應(yīng)分別制備酸堿顆粒，但會出現(xiàn)明顯的色差，且在含水量較高的的狀態(tài)下會發(fā)生反應(yīng)，并存在制粒和壓片困難、崩解不合格等一系列問題；而干法制粒則會有效避免上述問題。故筆者以顆粒得率和顆粒脆碎度為指標(biāo)，對影響四逆泡騰片干法制粒工藝的主要因素進行單因素考察，并采用Box-Behnken設(shè)計結(jié)合效應(yīng)面法優(yōu)化其工藝參數(shù)，為干法制粒在中藥制劑的應(yīng)用及四逆泡騰片的產(chǎn)業(yè)化提供參考和技術(shù)支持。

1 材料

1.1 儀器

GJ干法制粒機（寧波市江東華中機械制造廠）；MA45快速水分測定儀（德國Sartorius公司）；FT-2000脆碎度測定儀（天津市矽新科技有限公司）；ZK-025B電熱真空干燥箱（上海實驗儀器廠有限公司）；TE612-L電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；CFZ3.2BD除濕機（江蘇春蘭除濕設(shè)備有限公司）；SH2-D循環(huán)水式多用真空泵（鞏義市英峪儀器廠）；

1.2 試劑

四逆浸膏粉（江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心自制，含水量：25%）；酒石酸（安徽豐原生物化學(xué)股份有限公司）；碳酸氫鈉（河北海驊制藥廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 顆粒質(zhì)量評價及干法制粒方法

2.1.1 顆粒得率測定[3-6]取經(jīng)干法制粒的顆粒30 g，精密稱定質(zhì)量，置于24～60目（即二號與四號）藥篩中，保持水平狀態(tài)過篩，左右往返，邊篩動邊輕叩3 min，精密稱定質(zhì)量，按下式計算24～60目之間顆粒所占百分比（即顆粒百分率，為一次制粒得率）：顆粒百分率＝24～60目顆粒質(zhì)量/顆粒總質(zhì)量×100%。

2.1.2 顆粒脆碎度測定[3-6]取經(jīng)干法制粒的顆粒適量，過24目和45目藥篩，稱取24～45目顆粒約10 g，精密稱定質(zhì)量，置于脆碎度測定儀中，外加約200顆平均直徑為4 mm的玻璃珠，旋轉(zhuǎn)時間為10 min，轉(zhuǎn)速為25 r/min。為防止在旋轉(zhuǎn)過程中細(xì)小顆粒外泄，可用塑料密封圈密封。旋轉(zhuǎn)完畢后，移出玻璃珠，過45目篩，再稱定剩余顆粒的質(zhì)量，按下式計算顆粒脆碎度：顆粒脆碎度＝（測定前顆粒質(zhì)量－測定后顆粒質(zhì)量）/測定前顆粒質(zhì)量×100%。

2.1.3 四逆泡騰顆粒的制備 將酒石酸、碳酸氫鈉與四逆浸膏粉按處方要求混合均勻，調(diào)節(jié)好軋輪壓力和轉(zhuǎn)速后，將混合粉末加入到干法制粒機中壓成藥片，經(jīng)粉碎機粉碎成小顆粒后，整粒，取出顆粒，備用。

2.2 四逆泡騰片干法制粒影響因素考察

2.2.1 軋輪壓力對干法制粒的影響 取四逆浸膏粉適量，軋輪轉(zhuǎn)速固定為10 Hz（默認(rèn)值），分別設(shè)定軋輪壓力為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 MPa，考察軋輪壓力對顆粒得率、顆粒脆碎度的影響。結(jié)果顯示，顆粒得率隨著軋輪壓力的增加而提高，壓力從0.5 MPa上升到2.0 MPa時，顆粒得率顯著提高，而從2.0 MPa到2.5 MPa時，提高速率逐漸趨于平緩，原因可能是隨著軋輪壓力增加，壓輪間縫隙變小，致使未壓粉末的泄漏減少，并且粒子間排列更緊密，顆粒硬度增加，在破碎胚片過程中細(xì)粉減少，從而提高了顆粒的得率；顆粒脆碎度隨著軋輪壓力下降呈現(xiàn)出直線下降趨勢，這是由于粉末受到壓力增大時，物料粒子發(fā)生塑性形變程度增加，粒子間結(jié)合更加牢固。軋輪壓力對顆粒得率、顆粒脆碎度的影響分別見圖1、圖2。圖中數(shù)據(jù)通過SPSS 11.5軟件處理，經(jīng)ANOVA分析，得知軋輪壓力對顆粒得率和顆粒脆碎度的影響有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 軋輪壓力對顆粒得率的影響Fig 1 Effects of roller press on the yield of granules

圖2 軋輪壓力對顆粒脆碎度的影響Fig 2 Effects of roller press on friability of granules

2.2.2 軋輪轉(zhuǎn)速對干法制粒的影響 取四逆浸膏粉適量，設(shè)定軋輪壓力為2 MPa，軋輪轉(zhuǎn)速分別設(shè)定為6、9、12、15、18 Hz，考察軋輪轉(zhuǎn)速對顆粒得率、顆粒脆碎度的影響。結(jié)果顯示，軋輪轉(zhuǎn)速在6～18 Hz時，顆粒得率總體呈急劇下降趨勢；顆粒脆碎度隨著軋輪轉(zhuǎn)速增加呈現(xiàn)快速增大趨勢，原因可能是隨著軋輪轉(zhuǎn)速的增加，物料在軋輪間受壓的時間減少，粉體粒子塑性形變減小，顆粒結(jié)構(gòu)疏松，從而導(dǎo)致顆粒脆碎度增大和顆粒得率降低。軋輪轉(zhuǎn)速對顆粒得率、顆粒脆碎度的影響分別見圖3、圖4。圖中數(shù)據(jù)通過SPSS 11.5軟件處理，經(jīng)ANOVA分析，得知軋輪轉(zhuǎn)速對顆粒得率和顆粒脆碎度的影響有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 軋輪轉(zhuǎn)速對顆粒得率的影響Fig 3 Effects of roller speed on the yield of granules

圖4 軋輪轉(zhuǎn)速對顆粒脆碎度的影響Fig 4 Effects of roller speed on the friability of granules

2.2.3 浸膏粉含水量對干法制粒的影響 取四逆浸膏粉適量，調(diào)浸膏粉含水量分別為1.0%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%，設(shè)定軋輪轉(zhuǎn)速為9 Hz，軋輪壓力為2 MPa，考察浸膏粉含水量對顆粒得率、顆粒脆碎度的影響。結(jié)果顯示，隨著浸膏粉含水量升高，顆粒得率升高，其中浸膏粉含水量為1.0%～1.5%時，顆粒得率提高較顯著，而從1.5%到4.5%時，顆粒得率提高速率趨于平緩；顆粒脆碎度隨著浸膏粉含水量升高而降低，其中含水量為1%～2.5%時，顆粒脆碎度變化較顯著，而從2.5%到4.5%時，顆粒脆碎度變化趨于平緩，原因可能是當(dāng)浸膏粉含水量增加時，粉體壓縮過程中水能夠較好誘發(fā)浸膏的黏性，使得相鄰顆粒間形成的“固體橋”更加牢固，從而升高得率和降低脆碎度。浸膏粉含水量對顆粒得率、顆粒脆碎度的影響分別見圖5、圖6。圖中數(shù)據(jù)通過SPSS 11.5軟件處理，經(jīng)ANOVA分析，得知浸膏粉含水量對顆粒得率和顆粒脆碎度的影響有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖5 浸膏粉含水量對顆粒得率的影響Fig 5 Effects of the water content of extract powder on the yield of granules

2.3 干法制粒工藝優(yōu)化

在預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，確定了影響干法制粒過程及顆粒質(zhì)量的主要因素為軋輪壓力、軋輪轉(zhuǎn)速和浸膏粉含水量。筆者采用效應(yīng)面法結(jié)合Box-Behnken設(shè)計對四逆泡騰片干法制粒工藝進行優(yōu)化，并繪制三維效應(yīng)面和二維等高線圖。如果三維效應(yīng)面面的坡度相對平緩，表明其響應(yīng)值可以忍受處理條件的變異，不影響到響應(yīng)值的大小；如果坡度非常的陡峭，表明響應(yīng)值對于處理條件的改變非常敏感。二維等高線的形狀則反映出交互作用的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反，此時兩因素交互作用可忽略；等值線密的地方，對應(yīng)的坐標(biāo)所表示的因素為交互作用中的主要方面。

圖6 浸膏粉含水量對顆粒脆碎度的影響Fig 6 Effects of the water content of extract powder on the friability of granules

2.3.1 Box-Behnken設(shè)計 在單因素試驗基礎(chǔ)上，以浸膏粉含水量（X1）、軋輪轉(zhuǎn)速（X2）和軋輪壓力（X3）作為自變量，進行3因素3水平Box-Behnken設(shè)計。分別以－1、0、1對各自變量的低、中、高水平進行編碼，各編碼值與試驗值（x1、x2、x3）之間的轉(zhuǎn)換公式為：X1＝x1－2.5；X2＝（x2－9）/3；X3＝（x3－2）/0.5。再以顆粒得率、顆粒脆碎度作為響應(yīng)值，進行分析試驗。其中1～12為析因設(shè)計試驗，析因點位于自變量取值在所構(gòu)成的三維頂點[7]；13～17為中心點重復(fù)試驗，用來估計模型的誤差。對于多個響應(yīng)值（n≥2）的數(shù)據(jù)分析，常引入一個綜合指標(biāo)歸一值（OD）來反映總體的效應(yīng)結(jié)果，從而對試驗結(jié)果進行綜合評價[8]。即采用Hansan方法[9-10]先將各指標(biāo)值分別轉(zhuǎn)化為0～1的OD值，對取值越小越好的因素（顆粒脆碎度）和取值越大越好的因素（顆粒得率），先分別進行轉(zhuǎn)換求歸一值dmin和dmax，然后再以各歸一OD值求算幾何平均數(shù)，得到總評OD值。計算公式如下：dmin＝（Ymax－Yi）/（Ymax－Ymin）；dmax＝（Yi－Ymin）/（Ymax－Ymin）；總評 OD 值＝（d1d2d3……dK）1/K（K 為響應(yīng)值個數(shù)）。對于顆粒得率來說，取值越大越好；脆碎度則相反，取值在40%～60%范圍內(nèi)則越小越好，然后分別計算其OD值。Box-Behnken設(shè)計因素與水平見表1；Box-Behnken設(shè)計與試驗結(jié)果見表2。

表1 Box-Behnken設(shè)計因素與水平Tab 1 Factors and levels of Box-Behnken

2.3.2 模型擬合與數(shù)據(jù)分析 采用Design Expert7.0軟件對表2中總評OD值數(shù)據(jù)進行二項式回歸擬合分析。經(jīng)過F檢驗顯示，總評OD值回歸總模型有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.00001），R2＝0.9788，說明該回歸方程的代表性和模型的擬合情況良好；校正決定系數(shù)R2adj＝0.9516，說明該模型可解釋91.55%的效應(yīng)值變化，因此該模型擬合程度良好，能較準(zhǔn)確地預(yù)測實際情況。其二項式回歸方程為Y總評OD值＝0.87+0.031X1－0.067X2+0.35X3+（7.158×10－3）X1X2－0.047 X1X3+0.046 X2X3－0.18 X12－0.19 X22－0.22 X32；相對而言，其多元線性回歸方程為Y總評OD值＝0.59+0.031 X1－0.067X2+0.35 X3，相關(guān)系數(shù) R2＝0.6266，R2adj＝0.5404，明顯不如二項式回歸擬合效果好。總評OD值回歸模型系數(shù)顯著性檢驗見表3。

表2 Box-Behnken設(shè)計與試驗結(jié)果（n＝3）Tab 2Box-Behnken design and experiment（n＝3）

表3 總評OD值回歸模型系數(shù)顯著性檢驗Tab 3 Significance test of OD value regression model coefficient

由表3可知，各因素對工藝影響的大小順序為X3＞X2＞X1，即軋輪壓力和軋輪轉(zhuǎn)速對總評OD值的影響有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；浸膏粉含水量對總評OD值影響較小。

2.3.3 三維效應(yīng)面和二維等高線圖分析 根據(jù)二項式回歸方程，應(yīng)用Design-Expert7.0軟件繪制總評OD值與軋輪壓力、軋輪轉(zhuǎn)速和浸膏粉含水量的三維效應(yīng)面和二維等高線圖（另外一個自變量設(shè)為中心點值）。結(jié)果顯示，軋輪壓力的影響較浸膏粉含水量的影響更大，二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），當(dāng)軋輪壓力在1.5～2.5 MPa時，總評OD值隨著軋輪壓力的增大而增加；軋輪轉(zhuǎn)速與浸膏粉含水量的交互作用對總評OD值的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義，且等高線呈圓形，此時兩因素交互作用可忽略；軋輪壓力的影響較軋輪轉(zhuǎn)速的影響更大，二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），軋輪轉(zhuǎn)速在7.5～10.0 Hz時，總評OD值較高。優(yōu)選的制粒工藝范圍：軋輪壓力為2.0～2.5 MPa，軋輪轉(zhuǎn)速為7.5～10.0 Hz，浸膏粉含水量為1.5%～2.5%。三維效應(yīng)面和二位等高線圖見圖7。

圖7 三維效應(yīng)面和二維等高線圖A.軋輪壓力與浸膏粉含水量對總評OD值的交互影響（軋輪轉(zhuǎn)速為9 Hz）；B.軋輪轉(zhuǎn)速與浸膏粉含水量對總評OD值的交互影響（軋輪壓力為2 MPa）；C.軋輪壓力與軋輪轉(zhuǎn)速對總評OD值的交互影響（浸膏粉含水量為2.5%）Fig 7 Three-dimensional response surface and two-dimensional contour mapA.the effects of roller press and water content on OD value（roller speed 9 Hz）；B.the effects of roller speed and water content on OD value（roller press 2 MPa）；C.the effects of roller press and roller speed on OD value（water content 2.5%）

2.3.4 最佳干法制粒工藝的計算 為了更進一步求證最佳點的值，對回歸方程分別求X1、X2、X3的一階偏導(dǎo)，并賦值為零，得到以下方程組：0.031－0.36X1+0.007185X2－0.047X3＝0；－0.067+0.007185X1－ 0.38X2+0.046X3＝0；0.35－0.047X1+0.046X2－0.44X3＝0。求得：X1＝－0.02，X2＝－0.08，X3＝0.78，解得預(yù)測的總評OD值為：1.01408（總評值越大越好）。經(jīng)編碼轉(zhuǎn)換后，浸膏粉含水量為2.08%，軋輪轉(zhuǎn)速為8.76 Hz，軋輪壓力為2.29 MPa。綜合考慮到實際操作的需要與方便，確定最佳工藝為浸膏粉含水量為2.1%，軋輪轉(zhuǎn)速為8.8 Hz，軋輪壓力為2.3 MPa。

2.4 工藝驗證試驗

為了確定預(yù)測模型的可靠性，將酒石酸、碳酸氫鈉與四逆浸膏粉按處方要求混合均勻，按上述優(yōu)選的工藝制備3批四逆泡騰片，并測定顆粒得率和顆粒脆碎度以及總評OD值。結(jié)果顯示，平均實測OD值與模型預(yù)測OD值的相對偏差為－4.07%，說明該模型具有較好的預(yù)測性，所選工藝條件重現(xiàn)性較好。工藝驗證試驗結(jié)果見表4。

表4 工藝驗證試驗結(jié)果Tab 4 Results of validation tests

3 討論

筆者在研究過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)浸膏粉含水量為1.0%～2.5%時，顆粒得率變化較顯著，而從2.5%到4.5%時，顆粒得率變化趨于平緩。是否存在一個臨界含水量，使得顆粒得率和顆粒脆碎度同時達到極值呢？這將在下一步的試驗中繼續(xù)驗證。

本試驗采用Box-Behnken設(shè)計，數(shù)據(jù)采用效應(yīng)面法進行處理，用多元線性方程和二項式回歸方程對數(shù)據(jù)進行擬合，從復(fù)相關(guān)系數(shù)R2和P值可見，二項式擬合效果較多元線性效果好。

通過單因素試驗發(fā)現(xiàn)，軋輪壓力、軋輪轉(zhuǎn)速和浸膏粉含水量對顆粒得率和顆粒脆碎度影響最大，故以顆粒得率和顆粒脆碎度以及總評OD值為評價指標(biāo)，對四逆泡騰片顆粒干法制粒工藝進行優(yōu)化，經(jīng)驗證，優(yōu)選的制備工藝穩(wěn)定、可行。

[1]王曉林.中藥方劑“四逆湯"分析[J].中醫(yī)中藥，2010，7（16）：104.

[2]傅亮，饒小勇，黃愷，等.四逆泡騰片中揮發(fā)油的提取及其包合物的制備工藝研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，18（4）：5.

[3]Inghelbrecht S，Remon JP.Roller compaction and tableting of microcrystalline cellulose/drug mixtures[J].Int J Pharm，1998，161（2）：215.

[4]羅曉健，辛洪亮，饒小勇，等.板藍根干法制粒工藝研究[J].中國中藥雜志，2008，33（12）：1402.

[5]魏筱華，賴伊姍，黃愷，等.雙黃連泡騰片干法制粒工藝研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2010，16（11）：1.

[6]饒小勇，黃愷，張國松，等.感冒退熱泡騰片的干法制粒工藝研究[J].中草藥，2009，40（12）：1890.

[7]魏楨元，鐘耀廣，劉長江.響應(yīng)面優(yōu)化法對香菇多糖提取的工藝研究[J].遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（2）：11.

[8]伍永富，吳品江，魏萍，等.Box-Behnken設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化木犀草素-β-環(huán)糊精包合物的制備工藝研究[J].中草藥，2010，41（7）：1094.

[9]吳偉，崔光華，陸彬.實驗設(shè)計中多指標(biāo)的優(yōu)化：星點設(shè)計和總評“歸一值”的應(yīng)用.[J].中國藥學(xué)雜志，2000，35（8）：530.

[10]Abu-Izza KA，Garcia-Contreras L，Lu DR.Preparation and evaluation of sustained release AZT-loaded microspheres.2.Optimization of multiple response variables[J].J Pharm Sci，1996，85（6）：572.