維吾爾族婦女子宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)瘤變組織中micRNA-21表達及與人乳頭瘤病毒的關系

高冬梅 李小文 張媛媛 朱明玥 馬斌林

(新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院婦科，新疆 烏魯木齊 830011)

人乳頭瘤病毒(HPV)，特別是高危型病毒的感染在子宮頸鱗狀細胞癌的發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用〔1〕。microRNA(miRNA)是一類單鏈非編碼小分子RNA，在真核細胞中廣泛分布，可通過與靶基因的信使RNA的3'UTR端堿基相對或完全配對，導致靶基因的翻譯受到抑制，或者可以促進靶基因的降解，因此可以調(diào)控轉(zhuǎn)錄后的基因表達〔2〕。miRNA-21的編碼基因定位于17q23.2，即液泡膜蛋白基因(VMP1)編碼區(qū)，VMP1基因的第十內(nèi)含子〔3〕。miRNA-21在人類多種腫瘤組織中表達上調(diào)，例如乳腺癌、胃癌、肺癌等〔4～6〕。17q23.2同樣是HPV容易發(fā)生整合的區(qū)域〔7〕。HPV感染與女性宮頸癌的發(fā)生有密切聯(lián)系，是否由于HPV的整合而導致miRNA-21在該腫瘤細胞中表達升高還有待于進一步研究。本研究分析miRNA-21與高危型HPV感染之間的關系，探討其在子宮頸細胞惡性轉(zhuǎn)變以及宮頸鱗狀細胞癌(ICC)發(fā)生中的作用。

1 資料與方法

1.1 對象 收集新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院病理科2009年6月至2013年12月維吾爾族婦女子宮頸鱗狀細胞癌，宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)Ⅰ和Ⅱ級、CINⅢ級石蠟標本各20例，所有患者均未接受過放療、化療或者其他化學及物理治療。患者年齡29～70歲，平均46.5歲。

1.2 試劑 HPV16型探針(Y1407)和通用型檢測試劑盒(K0601)均來自美國Dako公司。TRIzol試劑購自Invitrogen公司，miRNA-21RT 引物、miRNA-21 Real time、U6 RT 引物、U6 Real time、2× PCR TaqMan Universal PCR ，TaqMan MicroRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 原位雜交法 3 μm厚石蠟組織切片脫蠟2次，無水乙醇2次，蛋白酶K消化。HPV16探針于載玻片上，加蓋玻片，加熱90℃ 5 min;42℃ 20 min，37℃過夜雜交;1×SSC和TBS2各沖洗3次;加檢測試劑，孵育37℃ 20 min，TBS3沖洗3次;反應物孵育1 h水洗，核固紅復染，脫水，封片觀察。

1.3.2 實時熒光定量PCR檢測miRNA-21 細胞總RNA采用Trizol一步法提取，RNA經(jīng)異丙醇法濃縮，總RNA的純度由分光光度計測定，總RNA的質(zhì)量經(jīng)甲醛變性凝膠電泳質(zhì)檢。根據(jù)試劑說明書操作，進行逆轉(zhuǎn)錄cDNA:反應條件:16℃ 30 min，42℃ 30min，85℃ 5 min。然后按 2×PCR TaqMan Universal PCR試劑盒說明書操作，應用U6 snRNA作為內(nèi)對照。分別以miRNA-21和U6第一鏈為模板，用miRNA-21和U6 snRNA熒光探針為引物擴增以上熒光PCR。所有的檢測均應用PRISM 7500型(Applied Biosystems，USA)熒光定量PCR儀進行測量，設立3個復孔，應用相對定量分析法2-△△CT進行結果分析。

1.4 統(tǒng)計學處理 運用SPSS19.0軟件，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，計量資料組間比較用t檢驗。

2 結果

2.1 HPV16在ICC CIN I和Ⅱ，CINⅢ級組織中的表達差異ICC組織中HPV16陽性率為75%(15/20);CINⅢ級HPV16陽性率為55%(11/20);CINⅠ和Ⅱ級組織中 HPV16陽性率為20%(4/20)。CINⅠ和Ⅱ級與CINⅢ級、ICC組比較差異顯著(P=0.024)，CINⅢ級與ICC組無顯著性差異(P=0.160)。

2.2 miRNA-21在ICC，CINⅠ和Ⅱ、CINⅢ級組織中的表達差異 ICC組織中 miRNA-21表達(8.19±1.96)較 CINⅢ級(5.19±1.75)及CINⅠ和Ⅱ級(3.78±0.81)病變明顯升高(P＜0.001)。CINⅠ和Ⅱ級、CINⅢ級組織中的miRNA-21表達也存在明顯的統(tǒng)計學差異(P=0.007)。

2.3 不同宮頸病變中miRNA-21表達及HPV16表達之間的關系 miRNA-21在 HPV16陽性病變組織中的相對表達量為4.62±0.74，明顯高于HPV16陰性病變組織中的表達(3.57±0.70)(P=0.014)。ICC和CIN I和Ⅱ級病變中，HPV16陽性病變組織中存在miRNA-21高表達的趨勢，但是無統(tǒng)計學意義;CINⅢ級病變中，在HPV16陽性和陰性組織中miRNA-21表達存在明顯的統(tǒng)計學差異。見表1。

表1 不同宮頸病變中HPV16陽性、陰性組miRNA-21表達比較(s)

表1 不同宮頸病變中HPV16陽性、陰性組miRNA-21表達比較(s)

與HPV16陽性比較:1)P＜0.05

HPV16 ICC CINⅢ CIN I和 Ⅱ陽性 8.69±1.98 6.04±1.81 4.62±0.74陰性 6.48±0.18 4.15±0.991) 3.57±0.70

3 討論

microRNA是一類內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達起負調(diào)控作用，參與生物細胞的增殖、生長、發(fā)育、凋亡等重要生理及病理過程〔8～11〕。研究發(fā)現(xiàn)miRNA-21在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著非常重要的作用，其表達量在各種腫瘤中均出現(xiàn)明顯上升，與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)化、增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成和對治療的抵抗等生物學行為都有關系〔3，5，9，12，13〕。目前關于miRNA-21在宮頸癌前病變及子宮頸癌病變中的研究還很有限。提示miRNA-21的表達失調(diào)可能在子宮頸上皮由癌前病變發(fā)展到子宮頸癌的過程中持續(xù)發(fā)揮作用。Yao等〔14〕應用實時定量PCR和原位雜交檢測技術研究了宮頸鱗狀細胞癌組織中和細胞株中miRNA-21的表達情況，研究結果顯示宮頸鱗狀細胞癌組織中和細胞株均存在miRNA-21的高表達，并且在宮頸鱗狀細胞癌細胞株中miRNA-21表達上調(diào)可能與HPV16陽性有關。本研究結果顯示miRNA-21在ICC癌前病變階段及由癌前病變進展到ICC過程中隨著病情發(fā)展其表達量呈現(xiàn)明顯的上升，提示miRNA-21有可能成為新的檢測宮頸癌的早期指標之一。已有研究報道血清標本中的miRNA-21可作為結腸癌診斷和預后標志物〔15〕。

細胞學實驗研究顯示了miRNA-21表達上調(diào)可能與HPV16陽性有關聯(lián)。由于病例數(shù)有限，在ICC和CINⅠ和Ⅱ級組織中miRNA-21在HPV16陽性和陰性病變中表達雖然不存在統(tǒng)計學差異，但是都呈現(xiàn)了HPV16陽性病變中更高的表達。上述研究結果提示miRNA-21失調(diào)及表達量的增加可能與HPV陽性子宮頸癌前病變和ICC的發(fā)生有密切關系。

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