金烏健骨方對膠原誘導性關節炎大鼠血清炎癥因子的影響

龍小琴 陸道敏 馬武開 (貴陽中醫學院研究生院，貴州 貴陽 550002)

苗藥金烏健骨方由金毛狗脊、烏梢蛇、千年健、黑骨藤、青風藤、姜黃、白芍、三七粉等藥物組成，具有溫腎助陽、散寒通絡、活血止痛之功效。前期的臨床研究顯示苗藥金烏健骨方能夠改善類風濕關節炎(RA)患者的臨床癥狀和體征〔1〕，尤其在降低抗風濕藥如甲氨蝶呤等的毒副作用方面顯示了較好療效〔2〕。本實驗觀察金烏健骨方對膠原誘導關節炎(CIA)大鼠血清炎癥因子白介素-1(IL-1)、白介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達的影響，研究金烏健骨方治療RA的機制。

1 材料與方法

1.1 動物 成年健康雌性Wistar大鼠60只，體重(173±20)g，由重慶滕鑫生物技術有限公司提供，合格證號:SCXK(渝)2009001。各組大鼠在相同條件下自由飲食、攝水。飼料來源于貴陽醫學院實驗動物中心。

1.2 主要試劑、儀器 牛二型膠原、完全弗氏佐劑(美國 Sigma公司);醋酸(無錫飛鵬精細化工有限公司);IL-1、IL-1β及TNF-α酶免免試劑盒(北京惠康生物科技有限公司);低溫冷凍離心機(德國eppendorf);冰箱(日本三洋);酶標儀(BioTek品牌，型號:Synergy 2 TM);電子秤(上海酬勤實業有限公司);大鼠足趾容積測量儀(淮北正華生物儀器設備有限公司)。

1.3 實驗藥物 ①金烏健骨方:金毛狗脊15 g，烏梢蛇10 g，千年健 15 g，黑骨藤9 g，青風藤30 g，姜黃20 g，白芍30 g，三七粉3 g(生藥購自貴陽中醫學院第二附屬醫院)等8味中藥組成。金烏健骨方濃縮液按處方比例提取，濃縮至1.5 g/ml，4℃冰箱保存供實驗用。②雷公藤多苷:湖南協力藥業有限公司生產，臨用時充分研磨后用蒸餾水配成混懸液，濃度為 1.2 mg/ml。

1.4 動物分組 60只SD雌性大鼠，適應性喂養3 d后，隨機分為空白組，模型組，雷公藤多苷組及金烏健骨方低、中、高劑量組共6組，每組10只。

1.5 造模 實驗前1 d用牛Ⅱ型膠原溶于0.1 mol/L醋酸中，4℃冰箱過夜，按2 mg/ml比例與弗氏不完全佐劑1∶1充分混合乳化。取適量牛Ⅱ型膠原溶液(濃度2 mg/ml)逐滴加入至等容積的不完全弗氏佐劑中，終濃度為1 mg/ml。冰浴中充分乳化，以滴入水中不擴散為度，取乳化后的混合物按0.3 ml注射。7 d后按 0.2 ml/只，于尾根部皮下加強免疫 1次〔3〕。

1.6 給藥 從第2次免疫后第1天開始給藥，空白組和模型組大鼠給予蒸餾水灌胃，2 ml/次，1次/d;雷公藤多苷組給予雷公藤多苷水溶液，劑量為6 mg/kg，2 ml/次，1次/d;金烏健骨方低、中、高劑量組分別給予不同質量濃度的金烏健骨方濃縮液(3 570、7 500、15 000 mg/kg)，2 ml/次，1 次/d，各組均連續灌胃28 d。

1.7 觀察指標 ①一般行為表現:動物神態、毛色、活動情況、飲食及飲水量、大小便。②體重:分別于造模前1 d用電子天平稱量各組動物體重以后每周稱量1次。③關節腫脹程度:分別于造模前1 d用大鼠足趾容積測量儀測量各組大鼠左后足踝關節容積。腫脹率=造模后足踝關節容積-造模前足踝關節容積/造模前足踝關節容積×100%。末次灌胃24 h以后，予烏拉坦按大鼠體重以0.4 ml/100 g予腹腔內注射麻醉，股動脈抽血4～6 ml，室溫靜置30 min后3 000 r/min離心15 min，用吸液管取血清，置于凍存管-20℃冰箱待測。④放射酶聯免疫學方法(ELISA)測定血清 IL-1β、IL-1、TNF-α 水平(嚴格按照說明書操作)⑤取CIA大鼠右膝關節滑膜及部分軟骨放于4%甲醛固定，8%EDTA溶液脫鈣，常規梯度脫水、浸蠟、包埋、切片，HE染色。光鏡下觀察普通病理變化。

1.8 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件分析，計量資料采用s表示，符合正態分布和方差齊性組間比較應用單因素方差分析，不符合正態分布的組間比較應用多個樣本的非參數檢驗。

2 結果

2.1 一般情況變化 空白組大鼠隨著飼養時間的延長，體重增加、活動自如、皮毛光澤、精神狀態良好，無異常狀態出現。模型組大鼠毛發干枯無光澤、飲食量及飲水量減少、精神萎靡，后期可見行走困難及關節活動障礙等。雷公藤多苷組及金烏健骨方各劑量組大鼠的飲食情況、精神狀態及關節活動障礙均較模型組好。

2.2 體重變化及左后足踝關節容積比較 造模前，各組大鼠體重關節大小無差異(P＞0.05)，灌胃2 w后體重比較，與空白組大鼠比較，模型組、雷公藤多苷組及金烏健骨方低、中、高劑量組大鼠體重增長減慢，灌胃4 w后模型組體重增長明顯低于空白組(P＜0.05)，見表1。關節腫脹于造模后4～5 d出現，模型組大鼠于第3周關節腫脹達到高峰，治療組大鼠均于第2周左右達到高峰，以后逐漸降低，其降低速度明顯快于模型組大鼠(P＜0.05)，金烏健骨方各劑量組比較，低、中劑量間無顯著性差異，而與高劑量間有極顯著性差異，表明用金烏健骨方3個劑量治療后，中、高劑量呈現劑量依賴性抑制佐劑性關節炎大鼠的足腫脹。見表2。

2.3 各組血清 IL-1β、IL-1、TNF-α水平 模型組大鼠血清中IL-1、IL-1β、TNF-α 值與空白組相比升高(P＜0.01)，說明造模成功;經金烏健骨方3個劑量及雷公藤治療后，IL-1β、IL-1、TNF-α水平均較模型組顯著減低(P＜0.05)。其中TNF-α在金烏健骨方低、中、高3個劑量中表達呈減少趨勢，表明金烏健骨方對CIA的TNF-α免疫抑制作用隨劑量增加而加強，并且在短時間內持續抑制。金烏健骨方對CIA大鼠的IL-1、IL-1β表達水平的影響與劑量關系無明顯的規律性。見表3。

2.4 金烏健骨方對CIA大鼠膝關節滑膜、軟骨病理的影響

空白組大鼠膝關節滑膜組織光滑完整，無炎細胞浸潤、血管增生及纖維素滲出。模型組滑膜組織可見明顯的血管增生、增厚、炎細胞浸潤、水腫，軟骨組織增生;隨著關節癥狀的加重，滑膜組織新生血管逐漸增多、血管擴張、充血，大量淋巴細胞浸潤。金烏健骨方高劑量組與雷公藤多苷組滑膜組織可見少量新生，未見骨小梁結構改變。金烏健骨方中劑量組可見少量新生血管及滑膜增生，少量炎細胞浸潤、水腫，軟骨輕度增生，少數關節軟骨破壞。金烏健骨方低劑量組可見明顯新生血管及滑膜增生、炎細胞浸潤、水腫，軟骨輕度增生及關節軟骨破壞程度較金烏健骨方中劑量組重。見圖1。

表1 各組大鼠體重變化(s，n=10)

表1 各組大鼠體重變化(s，n=10)

與空白組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與模型組比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01，下表同

組別 造模前1 d 灌胃2 w后 灌胃4 w后空白組 180.6±16.7 247.2±17.5 307.9±38.7模型組 178.9±14.4 209.9±19.41) 235.9±23.42)雷公藤多苷組 164.8±18.8 237.2±28.83) 274.3±18.93)金烏健骨方低劑量組 170.1±24.0 225.3±24.0 263.9±21.71)金烏健骨方中劑量組 168.8±18.2 221.8±22.2 285.1±19.33)金烏健骨方高劑量組 179±16.33) 241±11.23) 301.2±25.64)

圖1 各組大鼠關節滑膜組織病理(HE，×10)

表2 各組大鼠關節容積變化(s，n=10)

表2 各組大鼠關節容積變化(s，n=10)

組別 造模前1 d 灌胃2 w后 灌胃4 w后空白組 0.24 1.6 4.16 2.0 8.31 1.7模型組 0.27±1.9 35.0±5.92) 47.5±5.22)雷公藤多苷組 0.26±1.3 24.2±7.33) 11.7±4.64)金烏健骨方低劑量組 0.25±1.2 28.7±6.71) 25.1±2.32)3)金烏健骨方中劑量組 0.26±1.0 23.7±7.31)3) 17.3±3.71)3)金烏健骨方高劑量組 0.25±1.3 23.6±8.01)3) 10.2±1.74)

表3 各組IL-1β、IL-1、TNF-α水平比較(s，n=10)

表3 各組IL-1β、IL-1、TNF-α水平比較(s，n=10)

空白組 29.40±4.41 81.31±6.34 176.40±40.41模型組 69.15±5.852)138.37±4.541)380.15±83.852)雷公藤多苷組 36.59±3.273) 84.24±5.563)262.96±55.101)3)金烏健骨方低劑量組 32.97±4.21 99.38±6.323)334.02±38.182)金烏健骨方中劑量組 31.12±3.343) 87.33±7.783) 254±58.291)4)金烏健骨方高劑量組 32.17±2.384) 85.24±4.053) 189±38.104)

3 討論

RA是以對稱性多關節炎為主要臨床表現的慢性、進行性、侵襲性疾病，進行性的關節結構破壞時其病理學的主要特點，病理變化主要為關節滑膜的慢性炎癥，初期滑膜充血、水腫、增厚，血管翳形成，軟骨和軟骨下骨破壞。屬中醫“痹證”、“歷節”、“尪痹”范疇，本病的發生多以肝腎虧虛、筋骨失養、寒濕或濕熱入絡為主要病機，治療應以祛風濕、通經絡、補肝腎、強筋骨為主。金烏健骨湯中金毛狗脊、烏梢蛇有補肝腎、強腰脊、祛風濕、通經活血之效，千年健、小花青風藤、黑骨藤祛風止痛、強筋健骨，三七、姜黃活血止痛;白芍養血，緩急止痛，全方具有溫腎助陽、散寒通絡、活血止痛之功效。從補腎、強筋、健骨、活血、養血、祛風、通絡、定痛等多角度組方，形散而力專，配合精當。

本實驗觀察證明CIA大鼠具有與RA相似的慢性、反復發病的特點。本文結果說明金烏健骨方能控制CIA大鼠踝關節腫脹，對大鼠CIA有明顯的治療作用。關節滑膜是RA發病的靶器官，成纖維樣滑膜細胞是滑膜組織的重要組成部分，其分泌高水平促炎性細胞因子、化學趨化因子、基質蛋白降解酶等，持續刺激滑膜細胞，導致滑膜細胞的增殖與凋亡失衡，可誘發滑膜細胞增殖的刺激因素主要包括IL-1β，IL-1，TNF-α等。其中IL-1是一種重要的炎性細胞因子，它參與調節機體的免疫應答，炎癥等許多的過程，在慢性炎癥中IL-1的調節障礙、延遲合成以及釋放都會導致一些疾病的發生。IL-1包括IL-1a和IL-1β，IL-1、IL-1β能作用于內皮細胞促進嗜中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞聚集，引起RA關節局部炎癥反應發生。TNF-α是RA發病機制中處于重要地位的促炎性細胞因子，參與了RA多種致病機制，包括內皮細胞的激活、細胞因子的誘導、白細胞的聚集、破骨細胞的活化與軟骨的破壞等〔4〕。本實驗結果顯示，金烏健骨方治療組顯著抑制了IL-1β、IL-1、TNF-α的表達，對CIA大鼠有顯著的治療作用。

1 馬武開，鐘 琴，姚血明.苗藥金烏健骨湯治療類風濕關節炎的臨床觀察〔J〕.中華中醫藥雜志，2010;25(12):2190-2.

2 馬武開，鐘 琴，姚血明，等.苗藥金烏健骨湯對MTX治療類風濕關節炎耐藥患者增效作用研究〔J〕.中醫雜志，2010;51(5):61.

3 徐叔云，卞如濂，陳 修.藥理實驗方法學〔M〕.第3版.北京:人民衛生出版社，2002:920.

4 陳如平，王昌興，王偉東，等.類風濕性關節炎中腫瘤壞死因子-α的表達及意義〔J〕.醫學綜述，2011;17(5):647-9.