東菱克栓酶對大鼠腦缺血再灌注損傷后基質金屬蛋白酶-9表達的影響

孫 微 蔣維海 劉佳樂 韓 麗 (北華大學附屬醫院，吉林 吉林 3200)

東菱克栓酶(又叫巴曲酶，DF-521)是由巴西蝮蛇毒液中提取的單一成分酶制劑，可以選擇性作用于血纖維蛋白原Aα鍵末端的精氨酸、甘氨酸之間，分解纖維蛋白原為纖維蛋白單體，后單體聚合成多聚體，后者被DF-521分解為纖維蛋白降解產物，同時，其具有分解凝血因子Ⅰ、抑制血栓形成、降低血黏度、增強紅細胞變形能力、降低血管阻力等作用〔1～3〕。基質金屬蛋白酶(MMPs)是一組降解細胞外基質蛋白的鋅依賴蛋白酶，有研究顯示，腦缺血及再灌注后MMP表達增加，破壞血腦屏障;其中MMP-9與腦缺血再灌注損傷的關系尤為密切，在缺血早期血腦屏障損害中起著重要作用〔4～6〕。本研究探討腦缺血再灌注損傷后應用DF-521的治療作用及機制。

1 材料和方法

1.1 材料 東菱克栓酶注射液(巴曲酶)為北京托畢西藥業有限公司，一抗為MMP-9兔多抗(武漢博士德生物工程公司)，鏈霉素抗生物素蛋白過氧化物酶法(S-P)試劑盒購于北京中山生物技術有限公司。健康雄性Wistar大鼠，體重250～300 g，由吉林大學基礎醫學院動物實驗中心提供，合格證號:SCXK-(吉)2007-0003。清潔級動物室飼養，飲水不限，定時喂食。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及給藥 實驗動物按體重隨機分為5組，每組8只，分別為假手術組、模型組、OF-521高、中、低劑量組(16、8、4 BU/kg)，按常規進行飼養，進行不同的處理，每天上午灌胃1次，持續3 d后，建立腦缺血動物模型。假手術組、模型組每日給予生理鹽水灌胃(10 ml/kg)。

1.2.2 實驗動物模型建立 采用栓線法制備腦缺血再灌注模型。雄性健康Wistar大鼠，末次給予藥物2 h后10%水合氯醛(0.5 ml/100 g)麻醉。用微動脈夾于右側頸總動脈近心端夾住，用手術線于遠心端打一活結，用栓線通過事先用眼科剪在頸總動脈上剪出的切口進入向頸內動脈緩緩推入約18 mm，感到有輕微阻力且標記點在動脈分叉處停止，此時說明栓線已達到大腦前動脈。用手術線結扎固定栓線，縫合皮膚。假手術組只分離出頸外動脈以及頸內動脈，其他步驟同上，但不進行栓塞〔3〕。待大鼠清醒后，觀察大鼠的體征，出現以下體征者表明模型制作成功:右眼Honer＇s征;左前肢癱瘓，將鼠尾提起，大鼠不能充分伸展左前肢;當動物右旋時其左前肢拖在腹下，與右前肢交叉成剪刀狀;當右旋時，其左前肢掌面向上，被拖在身體的左側。48 h后立即斷頭取腦，觀察腦梗死面積，同時進行病理組織學、免疫組化檢測。

1.2.3 指標測定

1.2.3.1 大鼠腦梗死面積測定 實驗結束后立即對大鼠進行取腦，于-20℃冰箱放置2 min，便于保持相對固定，便于對腦組織行冠狀切片。將腦組織切成相對均勻的5片，避光于2%三苯基四氮唑(TTC)磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)37℃水浴中放置5～10 min，呈蒼白色可判定腦缺血。可應用BI2000軟件處理系統計算每個腦組織切片損傷面積和總面積，以5個腦組織切片中梗死面積之和與5個腦組織切片面積之和的百分比反映梗死范圍。

1.2.3.2 蘇木素-伊紅(HE)染色 將提取標本進行常規石蠟包埋切片，厚5 μm，HE染色，觀察缺血區細胞形態、大小、染色情況(×200)。

1.2.3.3 MMP-9免疫組化檢測 實驗模型成功后，進行心臟灌注固定，取視交叉前、后2 mm處的腦組織制作切片，腦組織取下后用石蠟包埋，制作厚約5 mm的連續腦切片。采用S-P染色法進行MMP-9免疫組織化學染色。細胞質著色呈棕黃色，經圖像分析儀每個切片隨機選擇5個視野。采用Image-ProPlus 6.0軟件檢測每張圖片積分光密度(IOD)值。

2 結果

2.1 各組腦梗死面積比較 與假手術組(0)相比，模型組的腦梗死面積(0.78±0.13)明顯增大，說明大鼠腦缺血模型建立成功;與模型組比較，DF-521高、中劑量組的腦梗死面積(0.56±0.10、0.66±0.08)顯著減小(P＜0.01，P＜0.05)，其中 DF-521 高劑量組較中劑量組效果更明顯(P＜0.05)。DF-521低劑量組腦梗死面積(0.75±0.11)與模型組比較差異不顯著。

2.2 HE染色結果 假手術組腦區細胞形態結構基本正常;模型組缺血區大部分細胞出現細胞核固縮、空泡樣改變，大量淋巴細胞浸潤;與模型組比較，DF-521高劑量組、中劑量組正常細胞較模型組明顯增多，僅少數細胞出現核固縮樣改變，且DF-521高劑量組改善更為明顯。DF-521低劑量組改善不明顯。提示DF-521對大鼠腦缺血再灌注病理學損傷具有保護作用。見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織病理變化(HE，×200)

2.3 DF-521對 MMP-9的影響 與假手術組(2 013.5±103.65)比較，模型組 MMP-9表達的 IOD值明顯增高(5 027.38±210.82)(P＜0.01);與模型組比較，DF-521 高、中劑量組 MMP-9表達的 IOD值明顯降低(2 918.80±165.56，3 624.40±196.82)(P ＜ 0.05)，DF-521 低劑量組 (4 928.20±182.42)未見統計學差異(P＞0.05)。其中 DF-521 高劑量組、中劑量組及低劑量組MMP-9表達的IOD值兩兩比較具有統計性差異(P＜0.05)。

3 討論

MMPs是一種Zn2+依賴性的蛋白水解酶，與缺血性腦卒中形成、發展和預后有很大關系。MMP-9是MMPs家族的核心成員，主要由血管壁的中性粒細胞和巨噬細胞合成和分泌，具有降解膠原蛋白和彈性蛋白的作用，從而破壞血管壁結構的完整性，并且破壞血腦屏障，導致滲漏和破裂，可引起血管壁基底膜破裂，促進斑塊纖維帽基質降解，導致斑塊不穩定，進而形成血栓，最終導致缺血性腦卒中的發生，甚至有些可能發生出血性轉化〔7〕。在生理情況下，MMP-9以無活性的酶原形式存在，在腦缺血時由于炎癥介質的作用，可能激活MMP-9，使其轉換為活性成分，MMP-9通過降解Ⅳ、Ⅴ型膠原，破壞ECM和基底膜，破壞血腦屏障的完整性，引起并且加重腦水腫〔8，9〕。有研究表明，給予MMP抑制物可以改善腦缺血再灌注損傷，減輕血管源性腦水腫，減輕腦損傷。本實驗研究結果顯示，局灶性腦缺血再灌注大鼠給予DF-521后可明顯減小梗死面積，并且隨著劑量的增加，作用越明顯。DF-521是強力降纖酶制劑，主要通過將纖維蛋白原轉化為可溶性纖維蛋白原，降低纖維蛋白原的濃度，從而降低血液黏制度，改善血液情況，降低外周血管阻力，增加腦血流量，以達到改善腦組織的供血、抑制血栓形成的作用。通過本實驗研究，認為DF-521降低MMP-9的表達可能是其作用機制之一。

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