P16、細胞周期蛋白D1在大鼠胃黏膜萎縮過程中的表達變化及意義

陳海金 王惠吉 (福建醫科大學附屬協和醫院急診科，福建 福州 35000)

慢性萎縮性胃炎(CAG)是消化系統常見病，由多種因素導致的，慢性胃炎尤其胃竇萎縮性胃炎與胃癌關系密切〔1，2〕。胃黏膜發生惡性變的過程中，存在細胞增殖的異常，這種細胞增殖的異常由多種癌基因、抑癌基因及凋亡調控因素共同參與調節。我國即將進入老年化社會，在老年群體中，胃黏膜組織的退行性萎縮非常普遍，老年人對疾病反應不敏感，一旦檢出胃癌往往已進入進展期癌，因此對萎縮性胃炎組織學及分子生物學改變進行研究十分必要。

1 對象與方法

1.1 研究對象 健康成年雄性SD大鼠，8周齡，體重200～250 g，共72只，購自北京維通利華實驗動物有限公司，飼養于首都醫科大學附屬北京友誼醫院動物實驗室。隨機分成正常對照組24只，模型組48只，兩組再根據時間點分為2，4，6個月組，對照組分別為8只，模型組實驗過程中有動物死亡，分別處死10，10，12只。

1.2 試劑、藥品及儀器 氨水(NH3OH)，乙醇，脫氧膽酸鈉:購自北京化學試劑公司;Cyclin D1免疫組化試劑及P16免疫組化試劑:Santa Cruz公司;Envision試劑:Dako公司。IMS細胞圖像分析系統:上海申騰信息技術有限公司。

1.3 動物模型誘導 參照文獻〔3〕，模型組采用 60%酒精8 ml/kg每3天空腹灌胃1次(前1 d晚上撤除飼料)，0.1%氨水自由飲用，20 mmol/L脫氧膽酸鈉8 ml/kg每天灌胃。對照組自由飲水及進食，共6個月。每周測量動物體重，根據體重調整藥物劑量。

1.4 標本制作及指標檢測

1.4.1 標本制備 動物處死前禁食24 h，以50 mg/kg的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，沿正中線剪開腹腔及胸腔，取全胃，沿胃大彎剪開，于冰鹽水中洗凈，肉眼觀察大體標本，沿胃小彎及大彎全長分別縱行切取寬約4 mm組織，置入4%甲醛溶液，固定24 h，石蠟包埋，切片，行HE染色。

1.4.2 病理組織學觀察 于光學顯微鏡下觀察胃竇和胃體部病理切片，萎縮性胃炎分級參考悉尼分級系統和萎縮聯誼會2000標準進行〔4〕，即腺體減少1/3位為輕度萎縮，減少在1/3到2/3之間中度萎縮，減少2/3以上為重度萎縮。

1.4.3 胃黏膜P16，Cyclin D1蛋白表達檢測 采用免疫組化Envision二步法。主要步驟:切片常規脫蠟至水;3%H2O2封閉10 min以消除內源性過氧化物酶，PBS沖洗;置于0.01 mol/L pH6.0檸檬酸緩沖液中抗原修復;1%二抗正常血清室溫下封閉20 min;不洗，加適當稀釋一抗(50 μl)，4℃冰箱過夜;PBS沖洗3次;Envision試劑37℃，15 min;PBS沖洗3次;0.04%DAB+0.03%H2O 28 min顯色，自來水洗3 min，蘇木素復染，常規樹脂封片。結果觀察:用已知陽性標本作陽性對照。陽性為棕黃色或棕褐色，并呈顆粒狀，背景呈紫藍色。用PBS代替一抗，作為陰性對照。用專業圖像分析系統分析免疫組化圖像中P16，Cyclin D1蛋白陽性區域面積和陽性比率，每張切片至少分析5個視野，取平均值(陽性面積率=單位面積中陽性反應的總面積/單位面積中細胞的總面積)。

1.5 統計學方法 應用SPSS13.0進行統計分析，結果以s表示。計量資料先進行方差齊性檢驗和正態性檢驗，符合條件的進行方差分析，否則作秩和檢驗。計數資料行χ2檢驗。

2 結果

2.1 病理組織學觀察

2.1.1 肉眼觀察 對照組胃黏膜皺襞完整，厚薄適中，表面光滑，色澤淡紅。模型組胃黏膜變薄，可見黏膜下血管。皺襞減少，色澤紫暗，胃黏膜有充血、糜爛、潰瘍等病變。

2.1.2 光鏡觀察 對照組大鼠胃黏膜內偶可見少量淋巴細胞及嗜酸細胞，模型組于第2個月可見大量淋巴細胞浸潤，部分可見淋巴濾泡形成，同時可見少量中性粒細胞浸潤。第4個月及第6個月組大鼠仍有大量淋巴細胞浸潤，但較第2個月組有所減輕，中性粒細胞浸潤不多見。

對照組大鼠胃竇小凹和腺體厚度約1∶1，腺體排列整齊，模型大鼠胃竇黏膜在2個月時即可見小凹增生，腺體輕度變薄，4個月及6個月組腺體有不同程度的排列紊亂，稀疏，腺體部纖維結締組織增生，黏膜肌層增厚，向黏膜固有層伸展呈分支狀插入腺體之間，伴有大量炎癥細胞浸潤，部分有成堆淋巴細胞聚集灶，胃小凹變寬，稀疏，腺體層變薄。

對照組胃體腺排列整齊，小凹較淺，腺體分布有大量壁細胞。模型組大鼠腺體逐漸出現小凹增生，小彎側胃體腺逐漸減少，為幽門腺所取代，部分大鼠甚至胃體腺消失，全部由幽門腺所取代，即發生幽門腺化生。大彎側胃體僅表現為小凹增生。見圖1。

2.1.3 病理結果 根據萎縮性胃炎診斷標準，造模2個月組基本上屬于慢性淺表性胃炎，少數為輕度萎縮性胃炎，而4個月及6個月模型組則基本達到中度萎縮性胃炎，少數為輕度或重度萎縮性胃炎(見表1)。4個月組及6個月組分別見1只大鼠胃小彎胃體腺為幽門腺所取代。

2.2 胃竇黏膜P16，Cyclin D1蛋白表達 P16陽性表達主要位于細胞核，在對照組大鼠高表達，模型組表達陽性面積較對照組有降低，6個月組較同期對照組降低有統計學差異(P＜0.05)(表2)。Cyclin D1蛋白表達于細胞核或細胞質，在正常胃黏膜低表達，模型組大鼠胃黏膜表達較正常組有所增加，2，4個月組及6個月組較同期對照組增加均有統計學差異(P＜0.05)(表2)。按萎縮程度分組，Cyclin D1在各種程度萎縮中的表達均較未萎縮者增高(P＜0.01)，而P16于中重度萎縮者表達較未萎縮者減低(P＜0.01)。見表3，圖2。

圖1 正常及CAG胃黏膜(HE，×40)

表1 各組大鼠胃竇黏膜病理定性結果(n)

表2 各組大鼠胃竇黏膜P16、Cyclin D1表達(s，%)

表2 各組大鼠胃竇黏膜P16、Cyclin D1表達(s，%)

與同期對照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別 n Cyclin D1 2個月組 4個月組 6個月組P16 2個月組 4個月組 6個月組對照組 8 12.58±5.57 12.93±5.43 11.84±4.79 24.88±5.92 26.13±5.91 26.33±6.61模型組 10 15.85±4.461) 18.94±5.522) 19.85±4.592) 22.94±3.78 23.02±5.58 21.38±5.511)

圖2 各組胃黏膜P16、CyclinD1蛋白表達(DAB，×100)

表3 p16、Cyclin D1在CAG不同胃竇黏膜病變中的表達(s，%)

表3 p16、Cyclin D1在CAG不同胃竇黏膜病變中的表達(s，%)

與無萎縮組比較:1)P＜0.05;2)P＜0.01

萎縮程度 n Cyclin D1 P16無 28 11.89±4.69 26.15±5.61輕度 12 16.74±4.932) 23.02±4.441)中重度 16 21.37±5.322) 20.27±4.832)

3 討論

臨床上，按Strickland分類法萎縮性胃炎可分為A和B二型，B型多見于胃竇部，呈多灶性分布，又稱多灶性萎縮性胃炎(MAG)，易發生腸型胃癌〔5〕，在中國、日本等胃癌高發地區多見，占萎縮性胃炎的95%以上。在本實驗中，綜合應用乙醇損傷胃黏膜模擬長期飲酒，以脫氧膽酸鈉模擬膽汁反流，以氨水模擬Hp感染導致的胃黏膜高氨狀態，聯合三因素長期慢性刺激胃黏膜，造成胃炎狀態持續存在。在實驗過程中，病理檢查發現胃黏膜變薄，可見淋巴細胞和中性粒細胞浸潤，可見小凹增生，胃竇黏膜變薄，腺體數目減少，黏膜肌層增厚，間質增生等表現，與人類萎縮性胃炎病理變化極為相似。

Cyclin D1是G期第1個合成的細胞周期蛋白，在G1/S期轉換中發揮重要作用，在受到有害生長信號刺激后Cyclin D1大量表達并與相應的細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)4或CDK6結合，導致CDK4或CDK6活化，促進DNA的合成，G期縮短，從而導致細胞失控性生長，有助于腫瘤的發生。研究表明，Cyclin D1在正常組織中表達很低，其過度表達是多種惡性腫瘤細胞的共有特征〔6〕。已有研究發現，Cyclin D1蛋白在早期胃癌和癌前病變中有過度表達〔7〕，其表達與胃癌的病理學類型、是否淋巴結轉移等沒有相關性〔8〕，提示Cyclin D1基因的擴增和過度表達可能發生在癌變的早期階段。本試驗中，實驗性萎縮性胃炎大鼠的胃黏膜Cyclin D1蛋白的表達出現明顯增高，出現高增殖狀態，這有助于受損胃黏膜的修復和再生，而處于高增殖狀態是具有惡性潛能的細胞，細胞增殖活躍，增加了自發性DNA復制錯誤的可能性，同時增加了內外源性致癌因子使DNA基因突變的發生機會，導致腫瘤發生〔9〕。

P16基因是一種多瘤抑制基因，其基因產物P16蛋白可與Cyclin D1競爭結合CDK4，抑制Cvclin D1/CDK4活性，從而使細胞停滯于G1期，抑制細胞增殖，呈現抑癌基因作用。在細胞周期調控中，P16的失活和其缺失或突變在腫瘤發生過程中起著重要作用。在早期胃癌和癌前病變中，發現P16蛋白表達低下，提示P16蛋白表達低下發生在胃癌發展過程的早期〔10〕。在本試驗中，大鼠萎縮性胃炎胃黏膜中P16蛋白表達尚未明顯缺失，但其表達程度已有明顯下調。Shapiro等〔11〕在研究中發現，P16蛋白表達缺失的出現率比p16基因的缺失出現率較高，認為p16蛋白表達缺失與p16基因的缺失關系不明顯，可能與p16基因的調控有關。大鼠胃黏膜病變中P16蛋白表達改變尚需以各種因素刺激造成更進一步的病變以及檢測更多相關基因進一步研究。

本實驗中，大鼠胃竇炎表現為單純萎縮性胃炎，沒有出現明顯腸上皮化生和異型增生，但其P16蛋白的表達是下降的而Cyclin D1蛋白表達是增加的，董西林等〔12〕通過制作十二指腸胃反流動物模型，也發現大鼠胃黏膜發生萎縮，異性增生等病變，并且也出現P16蛋白的表達是下降的而Cyclin D1蛋白表達增加，這一變化可能使胃黏膜細胞增殖增加，細胞凋亡受到抑制，張玲霞等的實驗證實萎縮性胃炎胃黏膜中存在細胞增殖增加和凋亡減少〔13〕，細胞增殖和細胞凋亡的平衡被打破，將有發展成胃癌的危險。

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