熒光法研究3，5-二溴水楊醛縮4-溴苯胺銅配合物與DNA的作用機理

(懷化學院 化學與化學工程系，湖南 懷化 418000)

因Schiff 堿及其配合物具有抗癌、抗腫瘤、抗菌、載氧和抑制超氧陰離子自由基活性等生物活性作用，而其配合物因具有更強的脂溶性和細胞穿透性，且不易產生耐藥性，擁有更好的醫藥價值[1-5].銅元素是一種許多生物酶都需要依靠的反應來激發其活性的重要生物元素，從而完成它在生物體中對新陳代謝過程的催化作用，因而銅的配合物的制備與其生物活性的研究成為一個廣泛的熱點領域[6，7].另外溴酚類化合物具有降血糖、抗菌、抗氧化和抗腫瘤等生物活性，近年來引起了藥物研究人員的重視[8，9].筆者以溴酚類化合物3，5-二溴水楊醛，參照文獻[10]合成了3，5-二溴水楊醛縮4-溴苯胺Schiff 堿，并制備了結構式圖1的二價銅的配合物，本文采用熒光光譜法對該配合物與DNA的相互作用的機理進行了研究.

圖1 3，5-二溴水楊醛縮4-溴苯胺銅配合物的結構式

1 實驗部分

1.1 試藥與儀器

三羥甲基氨基甲烷(Tris)(BR，含量≥99.9%)，魚精DNA (BR，含量≥99.9%)，溴化乙錠 (EB)(BR，含量≥98.0%)，pHS-2C 數字酸度計(杭州萬達儀器儀表廠)，RF-5301PC 熒光分光光度計(日本津島公司)，其它試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水.

1.2 緩沖溶液配制

緩沖溶液用二次蒸餾水配制，含有5 ×10-3mol/L Tris，5 ×10-2mol/L NaCl，鹽酸調節酸度使pH=7.22.

1.3 配合物溶液配制

取13.9 mg 配合物溶于100 mL 容量瓶中，用緩沖溶液使之溶解，另加入2%的DMSO 使配合物完全溶解，最后用緩沖溶液定容，使之形成2.8 ×10-4mol/L的溶液.

1.4 魚精DNA和EB 配制

稱取魚精DNA 10 mg 溶于100 mL 含有5 ×10-3mol/L Tris，5 ×10-2mol/L NaCl 緩沖溶液中，使其形成均勻溶液.用紫外光譜測定A260/A280的比值在1.8～2.0之間，說明純度符合要求[11].利用ε=6 600 dm3·mol-1·cm-1[12]計算溶液的濃度為3.35 ×10-4mol/L.用上述緩沖溶液配制100 mg/L的EB 溶液.配好的溶液保存于冰箱(4℃)中備用.

1.5 配合物與DNA-EB 作用的熒光光譜

在不同的10 mL 容量瓶中加入1 mL 魚精DNA和1 mL 溴化乙錠 (EB)溶液，在分別加入0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL和3.0 mL 2.8 ×10-4mol/L的配合物的緩沖溶液，然后以Tris-NaCl 緩沖液定容，避光作用12 h.在狹縫寬度為5 nm，激發波長260～320nm (λem=596 nm)和發射波長570～620 nm (λex=297 nm)進行熒光檢測.

1.6 Scatchard 圖

固定DNA的濃度為1.0 ×10-5mol/L，配合物的濃度依次增大(即配合物溶液與DNA 溶液的濃度比依次為0、0.25、0.5、0.75)，室溫反應12 h 后，用100 mg/L EB 溶液滴定(每次10 uL)，待其穩定 (約5 min)后，在狹縫寬度為5 nm，固定最佳激發波長和最佳發射波長(λex=297 nm，λem=596 nm)，測量加入不同EB 量時的熒光強度F，把數據代入Scatchard 方程進行計算，以r/c 對c 作圖，即得到不同濃度配合物的DNA 與EB 相結合時的Scatchard 圖.r是DNA 上平均每個核苷酸鍵合的EB分子數，c是自由EB的濃度.

1.7 DNA的熱變性行為

在含不同濃度配合物的DNA-EB 溶液中，按熒光實驗法配好溶液，固定最佳激發波長和最佳發射波長(λex=297 nm，λem=596 nm)，每升高5℃測量一次，測量20～90℃體系的熒光強度F.以F0/Ft對溫度作圖，即得DNA的熱變性曲線圖(F0為20℃時的熒光強度).

1.8 離子強度與DNA-EB 作用的熒光光譜

在4組含不同濃度配合物(分別為2.8 ×10-4mol/L，2.8 × 10-5mol/L，2.8 × 10-6mol/L，2.8 × 10-7mol/L)的DNA-EB 溶液中，分別加入不同濃度的NaCl 溶液 (即分別加入0、30、50、70、90、110 mmol/L的NaCl 溶液)，測其熒光強度F，以F/F0對NaCl 濃度作圖(F0為不含NaCl 時的熒光強度).

2 結果與討論

2.1 配合物對DNA-EB 熒光光譜的影響

EB 本身的熒光很弱，但能平行地插入雙螺旋DNA內部的堿基之間，從而使熒光顯著增強，當EB 從雙螺旋中出來或DNA 雙螺旋減少時，熒光顯著降低，因而EB可用作DNA 結構的熒光探針[13].

由圖2可見，隨著配合物濃度的增大，EB-DNA的熒光光譜的熒光強度變弱.且發射峰位略有紅移，發射峰位紅移是EB 由疏水環境進入親水環境的結果，表明配合物作用后，EB 從DNA分子中游離出來.認為配合物與DNA 作用可能有插入和靜電結合兩種，靜電作用使磷酸根上所帶負電荷被中和，使分子收縮，同樣可將EB 擠出.

為了解這種猝滅過程，根據經典Stern-Volmer 方程[14]:

圖2 不同濃度的配合物對EB-DNA 熒光猝滅的發射光譜圖

F0是不加猝滅劑時體系的熒光強度，F是加入猝滅劑時體系的熒光強度，Kq為動態熒光猝滅過程速率常數，[Q]表示猝滅劑濃度.τ0為猝滅劑不存在時熒光分子的平均壽命(大多數的熒光分子τ0值為10-8s)[15]，KD為Stern-Volmer 動態猝滅常數.以F0/F 對配合物濃度作圖，得到配合物對DNA-EB 熒光猝滅的Stern-Volmer 圖，如圖3所示.得到猝滅曲線的回歸方程F0/F=1.08021+5.227 ×103[Q]，相關系數r =0.9985.由斜率求得動態猝滅常數KD為5.227 ×103L·mol-1，從KD=Kqτ0得到動態熒光猝滅過程速率常數Kq為5.227 ×1011L·mol-1，遠大于各類小分子對生物大分子的最大擴散碰撞猝滅速率常數2.0 ×1010L·mol-1[16]，表明以上猝滅過程不是由于動態碰撞引起的，而是由于配合物與DNA 結合形成化合物引起的靜態猝滅.

圖3 配合物對DNA-EB 作用Stern-Volmer 圖

2.2 配合物與DNA 作用的Scatchard 圖

以EB作為熒光探針，研究配合物與DNA的相互作用，EB 與DNA的結合的特點可用Scatchard 方程[17]描述:

r/c=K (n-r)

式中r是DNA 上平均每個核苷酸鍵合的EB分子數，n是每個核苷酸上的成鍵位點數，K是每一點固有的結合常數，c是自由EB的濃度，以r/c 對r 作圖得到一直線.利用藥物存在下的Scatchard 圖可判別藥物的作用方式[18]，當藥物以插入方式與DNA 鍵合時，即藥物與EB 對DNA 上同一位點的結合是競爭性的，則Scatchard 圖中K值變化，n值不變;當藥物以靜電方式與DNA 結合時，即藥物與EB 對DNA 上不同位點的結合是非競爭性的，則Scatchard 圖中n值變化，K值不變;當藥物與DNA的結合存在插入和非插入兩種方式時，則表現混合型，Scatchard 圖中K值及n值都將改變.

由圖4，根據直線的斜率和截距，可求得配合物DNA-EB 體系核苷酸上每一位點固有的結合常數K值分別為:1.625 ×106L·mol-1，1.128 ×106L·mol-1，8.718 ×105L·mol-1，4.159 ×105L·mol-1;每個核苷酸上的成鍵位點數n分別為:0.23，0.20，0.18，0.17.表明隨著配合物濃度的增大DNA 與EB的結合常數K 改變，而DNA 上平均鍵合位點數n 也改變，這是典型的混合型模型.因此配合物在與DNA 作用時，配合物與DNA的磷酸基團可能發生靜電結合，也可能以部分希夫堿配體插入到DNA 雙螺旋堿基對中.

圖4 DNA 在不同濃度配合物下的Scatchard 圖

2.3 溫度對DNA 熱變性行為的影響

由圖5可見，隨著配合物濃度的增加，DNA的熔解溫度逐漸降低，熔解熱逐漸減小.這是因為在離子強度很小的溶液中，DNA 上的電荷不能有效的被中和，DNA 雙鏈間的靜電排斥力很大，DNA 不能穩定地存在于這種溶液中.按照Debye-Huckel 離子屏蔽理論[19]，當有鹽類加入時，DNA 中帶負電荷的磷酸基團可以被中和也就是正離子圍繞在磷基團周圍形成“離子云”有效地屏蔽了磷酸基間的靜電斥力，DNA 將更加穩定，Tm(熔解溫度)值將上升[20].然而實驗結果卻與此相反.這說明DNA 與配合物之間除了靜電作用外，應該還有其它作用力，可能是部分的希夫堿配體插入了DNA 中.

圖5 不同濃度配合物對DNA的Tm的影響

2.4 鹽濃度對DNA-EB 體系的熒光強度的影響

由圖6可見，隨著離子強度的增加，配合物DNA-EB 體系熒光強度均明顯升高，雖然離子強度增加對純DNA-EB 本身有一定的粹滅作用，但在配合物存在下，體系總的熒光強度仍在增加，表明配合物對DNA-EB 熒光碎滅程度的減弱，這是由于Na+等鹽類陽離子以靜電作用與DNA的磷酸基團作用而使周圍形成一個陽離子氛，從而使帶正電荷的配合物不易靠近，減少了對的DNA的作用，因此熒光強度增加[13].

圖6 不同濃度NaCl 對配合物與DNA-EB 熒光強度的影響

3 結論

3，5-二溴水楊醛縮4-溴苯胺銅配合物與DNA-EB 相互作用的體系的熒光強度具有靜態猝滅作用，以及配合物在不同濃度下的Scatchard 圖表現為混合型抑制模型，其結合常數K和成鍵位點數n 隨著配合物濃度的改變而改變，表明配合物與DNA 作用可能有插入和靜電結合兩種模式.離子強度對配合物DNA-EB熒光光譜的影響中，隨著離子強度的增加，體系熒光強度均明顯升高，這是配合物與DNA之間有靜電作用的表現.DNA 熱效應實驗中，隨著配合物濃度的增加，DNA的熔解溫度逐漸降低，說明DNA 與配合物之間除了靜電作用外，應該還有其它作用力，可能是部分的希夫堿配體插入了DNA 中.

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