蛋白質標準物質的制備概況

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(1. 南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047; 2. 南昌大學中德聯合研究院,江西南昌 330047; 3. 江西中醫藥大學護理學院,江西南昌 330004; 4. 溫州大學生命與環境科學學院,浙江溫州 325035)

蛋白質是一類重要的生物分子,其標準物質是建立蛋白質量值溯源傳遞體系,實現蛋白質計量的重要器具。研究發現,蛋白質可作為健康或疾病的標志物,常用于商業分析[1 - 2]。例如,測量的蛋白質血清心肌肌鈣蛋白I已成為心肌梗死(心臟病發作)的臨床診斷“金標準”。這些測量的準確度是否可靠是臨床診斷的依據,不同的臨床實驗制造商采用不同的校準器和不同的特異性抗體,因此這些商業分析系統給出的結果,可比性較差。只有按標準測量程序參照標準物質定量的結果,才能使臨床檢測和診斷實現標準化。

食物的成分準確分析,也有賴于標準物質的應用。以過敏原蛋白為例,食物過敏研究的數據顯示,制備過敏原蛋白質標準物質用于安全檢測是非常必要的[3]。若未采用標準物質,不同的檢測結果可能有數倍以至幾十倍的差異[4 - 5],結論難以令人信服。為了實現實驗結果的可比性、準確性和可溯源性[6],標準物質的使用是必須條件。

蛋白質標準物質在臨床醫學和食品衛生領域有著重要地位,包括用于腫瘤細胞的檢測[7]、糖尿病診斷[8]、藥物篩選、抗體檢測[9]、轉基因食品、食物過敏[10]和食品添加劑的檢測等。隨著蛋白質疾病、腫瘤標志物在臨床檢驗中的應用,蛋白質功能食品的興起,以及對食物過敏等食品安全問題的重視,市場將有更多的蛋白質標準物質需求。蛋白質標準物質是蛋白質檢測,尤其是定量分析中使用的實物標準。作為計量學上的計量器具之一,標準物質一直是國內外標準化組織研究的重要內容,其制備和使用直接影響到蛋白質檢測數據的可靠性和有效性。但因受到實驗室技術裝備、蛋白質自身性質和計量溯源性等條件的制約,蛋白質標準物質難以標準化生產,現有蛋白質標準物質的種類相對較少。未來蛋白質標準物質的制備應結合蛋白質計量的需求以及蛋白質計量技術的發展方向,提高蛋白質標準物質的質量,增加供應種類[11]。

1 標準物質和有證標準物質

1. 1 標準物質(Reference Material)

標準物質是具有一種或多種足夠均勻和良好確定特性,用以校準測量設備、評價測量方法或給材料賦值的一種材料或物質[12 - 13]。定義中的“特性”是包括標準物質的化學成分、物理性質、工程參數等[14 - 15]。

1. 2 有證標準物質(Certified Reference Material)

有證標準物質是附有認定證書的標準物質,其一種或多種特性量值用建立了溯源性的程序確定,使之可溯源到準確復現的表示該特性值的測量單位。每一種認定的特性量值都附有給定置信水平的不確定度。

2 蛋白質標準物質的制備與表征

2. 1 標準物質的制備和質量控制

標準物質的制備和表征應按照ISO導則[16 - 18]、2000年版《中國生物制品規程》和《一級標準物質技術規范》[19]的要求進行制備。制備蛋白質標準物質,首先蛋白質純化所采用的方法應是常規、簡單和公認的。純化蛋白質的一般步驟為:蛋白質的粗提取,對目標蛋白質進行分餾、濃縮和穩定化,去雜質,后期純化[20 - 21]。理想的蛋白質分離提純方法,需要在保持蛋白質生物活性的前提下,達到蛋白質標準物質的純度要求。

標準物質初步檢查主要包括:外觀初步檢查,蛋白質標準物質可以是固體粉末狀顆粒,也可以是溶液狀態；理化特性表征,包括吸水性、pH等；另外還需對蛋白質進行無菌檢查、純度及雜質檢查。檢查結果符合各方面的要求后,方能進行分裝和包裝。

2. 2 蛋白質標準物質的結構表征及常用的蛋白質數據庫

國際物質量咨詢委員會(CCQM)于2001年確定的蛋白質計量研究內容包括蛋白質定量、相對分子質量、蛋白質功能、生物學活性[22]以及蛋白質的高級結構等[23]。蛋白質鑒定的第一步往往就是測定其分子量,分子量的正確與否預示著該多肽或蛋白質的一級結構是否正確。質譜技術(Mass Spectrometry,MS)[24]為快速準確地獲取蛋白質的一級結構信息提供了權威的檢測技術手段。圓二色光譜(CD)可以用來定量估計蛋白質在溶液狀態下的各種二級結構(如α - 螺旋,β - 折疊,β - 轉角和無規卷曲)。

蛋白質標準物質的結構表征離不開蛋白質數據庫,常用的蛋白質數據庫有:PDB、ISSD、HSSP、SCOP等。

蛋白質的基本立體結構數據庫為PDB(Protein Data Bank),1971年建立于美國布魯海克海文國家實驗室。該數據庫中收集了通過X射線衍射和核磁共振(NMR)實驗測定的蛋白質結構的精確坐標數據。這種數據即蛋白質中的原子坐標是蛋白質結構的最細致的層次。該數據庫的管理者是結構生物信息學合作研究組織(Research Collaboration for Structural Bioinformatics,RCSB)。

ISSD蛋白質數據庫,其每個條目包含一個基因的編碼序列,同相應的氨基酸序列對比,并給出相應多肽鏈的結構數據。核苷酸序列取自GenBank,結構參數來自PDB,包括多肽骨架原子坐標,二面角,還有DSSP程序所預測的二級結構。

HSSP是根據同源性導出的蛋白質二級結構數據庫。每一條PDB項目都有一個對應的HSSP文件。該數據庫同時提供了SWISS - PROT數據庫中所有蛋白質序列的同源性。

蛋白質結構分類數據庫(structural classification of proteins,SCOP)是對已知的蛋白質三維結構進行手動分類得到的數據庫,將已知結構蛋白質進行有層次地分類。該資源允許用戶分析查詢蛋白質是否和已知結構蛋白質具有相似性。

2. 3 蛋白質標準物質的延續性

蛋白質標準物質的延續性是指標準物質在一定范圍內,能夠在不同時間、空間用于檢測分析和統一量值。蛋白質標準物質是一種消耗性物質,因此必須保證標準物質的制備是可以延續的,即標準物質必須有足夠的批量,且能夠迅速地再生產獲得。

2. 4 新技術的應用

一般而言,蛋白質穩定性的主要影響因素包括二硫鍵、氫鍵和鹽橋等,而這往往也是提高蛋白質穩定性的著力點。提高蛋白質的穩定性,可考慮降低折疊與非折疊的熵差,減少非折疊的構象,還可通過穩定α螺旋和填充疏水內核,使蛋白質構象處于能量最低狀態和最穩定狀態[25]。蛋白質工程技術[26]通過對蛋白質進行修飾,改造和拼接以生產出能滿足標準物質制備要求的蛋白質。另外,通過基因工程菌的重組和表達[27],可擴大蛋白質標準物質的制備規模,滿足蛋白質檢測分析的計量需求。

3 均勻性檢驗和穩定性評價

3. 1 均勻性檢驗

均勻性檢驗按照《一級標準物質技術規范》[19]的要求,確定抽樣方法、抽取單元數和最小取樣量[28],測量取自不同包裝單元(如:瓶、包等)或同一包裝單元以及特定大小的樣品。影響蛋白質標準物質均勻性的因素有:純度、分裝精度及其自身的化學形態和結構狀況,并保證均勻性檢驗實驗條件的一致性。

數據統計分析按照ISO導則35(2006版)[18]的要求,檢查蛋白質標準物質的檢測結果。通過均勻性檢驗結果,一方面說明特性值在各個部位之間是否均勻；另一方面要測定標準樣品的特性值在不同部位之間不均勻的程度,即確定不確定度,并說明可能的變化來源,進而判斷不均勻性程度是否可以接受。若測量結果落在規定不確定度范圍內,則可認為標準物質所指定的特性是均勻的[29],為考查蛋白質標準物質的穩定性做好準備。

3. 2 穩定性評價

標準物質的穩定性,是指在規定的儲存和使用條件下,在規定的時間間隔內,其特性量值在規定的范圍內保持不變的能力,是標準物質的基本性質之一。標準物質的穩定性考察及評價應真實地反映出該標準物質穩定性能,使標準物質能在有效期內發揮其量值傳遞的作用。

3. 2. 1 穩定性評價的方法 穩定性的檢測有影響因素實驗、加速實驗[22]和長期實驗。穩定性檢驗的測試方法應是精密和靈敏的,并且具有很好的重現性。對于新研制的標準物質,隨機取一最小單元,從新研制完成開始,測定其標準物質特性量值隨時間變化的情況,此最小單元在考察的時間間隔按此標準物質的存放條件保存,以確保穩定性實驗的有效性和準確性。評價標準物質的穩定性有t檢驗法和平均值一致性檢驗法[30],以統計分析標準物質的特性值是否發生顯著性變化。

3. 2. 2 影響蛋白質標準物質穩定性的因素 影響穩定性的因素主要有:光、溫度和濕度等物理因素；溶解、分解和化合等化學因素及細菌作用等生物因素。由于蛋白質不穩定,容易降解,可能需要避光低溫貯藏。此外,殘留水分含量也有可能影響標準物質的穩定性[31]。考察分析蛋白質標準物質在環境因素影響下的變化規律,可以為蛋白質標準物質的生產、包裝、貯藏、運輸條件提供科學依據[32 - 33]。

4 蛋白質標準物質的定值及不確定度的評定

蛋白質標準物質定值是采用技術上正確的方法進行測定,確定蛋白質標準物質的特性值,并由測定不確定度組成。

4. 1 定值方式

標準物質特性值的測定有幾種技術上有效的方式。按定值內容來選擇測量方法及具體測量方案(即采用單個實驗室、一種權威的測量方法或是采用多個實驗室合作研究)[34]。具體選擇哪一種方法應根據標準物質的類型、最終使用需求、實驗室所具備的資質和所用方法的質量水平來評估特性值的不確定度。WHO生物制品標準化專家委員會通常采用國際間實驗室聯合定值的方法[35 - 36]。

根據《一級標準物質技術規范》和ISO導則35,定值分析要求每個實驗室至少提供一個最小單元(瓶)特性量值的測定結果,每瓶樣品至少提供2個以上特性值的重復測量數據,測量數據都保留4位有效數字。定值分析所使用的樣品瓶號是隨機抽取的。

4. 2 定值范圍

準確檢測蛋白含量是實現標準物質溯源傳遞的基礎,其測定按照2005年版中國藥典三部方法進行[37]。對于純蛋白質,常規的蛋白質含量測定方法包括氨基酸分析、定氮法以及純度扣除法等,目前國際公認的權威方法包括精密庫侖法、同位素稀釋質譜法、重量法、容量法、凝固點下降法等[38]。此外,免疫技術也應用于蛋白質的定性和定量[39]。

4. 3 與國際標準物質的比較

研制標準物質與國際標準物質的譜圖相同,國際標準物質經稀釋后,兩者的譜圖幾乎重合,說明兩種標準物質所含的物質相同；用本研究的定值方法對國際標準物質進行測定,定值結果與國際標準物質的定值相對比無顯著差異,則說明標準物質的定值方法準確、可靠。

4. 4 定值結果的統計處理

蛋白質檢測結果不確定度的評定依照JJF1059 - 1999《測量不確定度評定與表示》[40]。定值數據分析首先經Dixon檢驗、Gmbbs檢驗判斷有無離群值,經相應處理后,并根據不確定度公式計算出定值的不確定度[41]。

標準物質的特性量值具有準確計量的或嚴格定義的認定值,認定值與真值的偏離程度不超過計量方法的不確定度。當用計量方法確定認定值時,認定值就是被測定特性量值之真值的最佳估計值,認定值與真值的偏離程度不超過計量方法的不確定度。

通常標準物質證書中都要給出認定值及其不確定度。認定值總不確定度的分析(即定值分析數據平均值的平均值)的總不確定度來源由3部分組成:一是通過測量數據的標準偏差、測量次數及所要求的置信概率按統計方法計算得出,并對測量的其它一些影響因素作出分析估算出其大小；二是物質的均勻性引起的不確定度的估計；三是物質在有效期內穩定性發生變動引起的不確定度分量。

4. 5 蛋白質標準物質不確定度的評定

根據ISO導則35,標準物質特性量值的不確定度評定[42]主要包括四個部分:方法定值的不確定度；標準物質瓶間不均勻性產生的不確定度；標準物質特性量值的長期穩定性所引起的不確定度；標準物質特性量值的短期穩定性所引起的不確定度。

利用ISO導則35所給出的公式計算標準物質定值的標準不確定度,將標準不確定度乘以包含因子,計算得到定值結果的擴展不確定度,根據其與真值的接近程度判斷是否達到標準物質的測量需求。

5 結語

國內外眾多標準化組織及計量科學工作者正致力于蛋白質標準物質的研究,并把蛋白質標準物質作為計量工具的完善和補充。蛋白質標準物質的制備,需要建立起系統的蛋白質標準物質制備流程及方法,嚴格執行質量控制,采用權威方法聯合多家實驗室定值。蛋白質標準物質可應用于臨床檢驗、生物醫藥、食品安全等領域,為蛋白質的分析檢測提供可靠的量值溯源保證,應用前景十分廣闊。

[1]Xinhua Dai,Xiang Fang,Mingwu Shao,etal. Carried reference materials(GBW09170 and 09171)of creatinine in human serum[J]. Journal of Chromatography B,2011,879(2011):429 - 435 .

[2]Van Ree R,Chapman M D,Ferreira F,etal. The CREATE Project:development of certified reference materials for allergenic products and validation of methods for their quantification[J]. Allergy,2008,63(3):310 - 326.

[3]Burks A W,Tang M,Sicherer S,etal. ICON:Food allergy[J].Journal of Allergy and Clinical Immunology,2012,129(4):906 - 920.

[4]Jillian R Tate,David M Bunk,Robert H Christenson,etal. Standardisation of cardiac troponin I measurement:past and present[J]. Pathology,2010,42(5):402 - 408.

[5]Mauro Panteghini,David M Bunk,Robert H Christenson,etal. Standardization of troponin I measurements:an update[J]. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine,2008,46(11):1501 - 1506.

[6]S Vasikaran,R Eastell,O Bruyere,etal. Markers of bone turnover for the prediction of fracture risk and monitoring of osteoporosis treatment:a need for international reference standards[J]. Osteoporosis International,2011,22(2):391 - 420.

[7]Poon T C,Sung J J,Chow S M,etal. Diagnos is of gastric cancer by serum proteomic fingerprinting[J]. Gastroenterology,2006,130(60):1858 - 1864.

[8]徐國賓. 糖尿病診斷標準的完善及糖化血紅蛋白A1c檢測的標準化[J]. 臨床檢驗雜志. 2012,30(6):401 - 405.

[9]Planitzer CB,Saemann MD,Gajek H,etal. Cytomegalovirus neutralization by hyperimmune and standard intravenous immunoglobulin preparations[J]. Transplantation,2011,92(3):267 - 270.

[10]周煌,楊安樹,佟平,等. 食物過敏原標準物質的研究進展[J]. 食品工業科技,2012,33(23):438 - 442.

[11]武利慶,王晶,楊彬,等. 蛋白質含量標準物質研究現狀及趨勢[J]. 計量學報,2010,31(5):125 - 127.

[12]王根榮. 國家標準物質有關名詞與術語介紹[J]. 上海計量測試,2002,29(5):40 - 41.

[13]ISO Guide 30. Terms and Defnitions Used In Connection With Reference Materials. International Organization for Standardization[S]. Switzerland(1992).

[14]李紅梅,劉菲,李孟婉. 標準物質及其在分析化學中的應用[M]. 北京:中國計量出版社,2006:2 - 3.

[15]趙偉. 談談標準物質的應用[J]. 計量與測試技術,2007,34(2):22 - 23.

[16]ISO Guide 30,Terms and definitions used in connection with reference materials[S]. 2nd edn. Geneva,1992.

[17]ISO Guide 35,Certification of reference materials General and statistical principles[S]. 2nd edn. Geneva,1989.

[18]ISO Guide 35,Reference materials - General and statistical principles for certification[S]. 3rd edn. Geneva,2006.

[19]JJF 1006 - 1994中華人民共和國一級標準物質研制技術規范[S]. 北京:中國計量出版社,1994.

[20]Ashkan Madadlou,Siobhan O’Sullivan,David Sheehan. Fast Protein Liquid Chromatography[J]. Protein Chromatography,2011(681):439 - 447.

[21]李校堃,袁輝. 藥物蛋白質分離純化技術[M]. 北京:化學工業出版社,2005:9 - 22.

[22]Zegers I,Keller T,Schreiber W,etal. Characterization of the new serum protein reference material ERM - DA470k/IFCC:value assignment by immunoassay[J]. Clin. Chem,2010,56(12):1880 - 1888 .

[23]武利慶,王晶,楊彬. 蛋白質相對分子質量標準物質定值結果的溯源性[J]. 中國計量,2009(5):81 - 82.

[24]John R Yates,Cristian I Ruse,Aleksey Nakorchevsky. Proteomics by Mass Spectrometry:Approaches,Advances,and Applications[J]. 2009(11):49 - 79.

[25]Vincent G H Eijsink,Alexandra Bjork,Sigrid Gaseidnes,etal. Rational engineering of enzyme stability[J]. Journal of Biotechnol,2004(113):105 - 120.

[26]Mark Cornell Manning,Danny K Chou,Brian M Murphy,etal. Stability of Protein pharmaceuticals:An Update[J]. Pharmaceutical Research,2010,27(4):544 - 575.

[27]I Lauer,N Dueringer,S Pokoj,etal. The non - specific lipid transfer protein,Arah9,is an important allergen in peanut[J]. Clinical and Experimental Allergy,2009(39):1427 - 1437.

[28]韓永志. 標準物質的均勻性及其檢驗[J]. 化學分析計量.2001,10(3):34 - 35.

[29]國家質量監督檢驗檢疫總局. 2006. 中華人民共和國國家計量技術規范(JJF 1005 - 2005),標準物質常用術語和定義[S]. 北京:中國計量出版社.

[30]韓永志. 標準物質的穩定性監測及評價[J]. 化學分析計量. 2001,10(4):37 - 39.

[31]Cumby N,Ying Zhong,Naczk M,etal. Antioxidant activity and water - holding capacity of canola protein hydrolysates[J]. Food Chemistry,2008,109(1):144 - 148.

[32]朱征宇,汪恩浩,王媛. 應用統計分析和化學動力學參數評價生物制品的穩定性[J]. 中國生物制品學. 2008,21(2):126 - 130.

[33]Kirkwood TBL. Predicting the stability of biological standards and products[J]. Biometrics,1977,33(4):736 - 743.

[34]陳柏年,徐大軍. 標準樣品的定值概念[J]. 中國標準化,2005(7):74 - 76.

[35]Javier Martin,Gillian Cooper,Laura Stephens,etal. Report on the WHO collaborative study to establish the 3rd International Standard(replacement)for inactivated polio vaccine[R]. Expert Committee on Biological Standardization. Geneva,2009.

[36]Caroline Vipond,Barbara Mulloy,Peter Rigsby,etal. Evaluation of a candidate International Standard for Meningococcal Group C Polysaccharide[J]. Biologicals,2012(40):353 - 363.

[37]國家藥典委員會編. 中國人民共和國藥典2005年版三部[S]. 北京:化學工業出版社,2005.

[38]武利慶,王晶,謝寶民,等. 淺談蛋白質含量量值溯源傳遞體系的構建[J]. 化學分析計量,2009,18(3):73 - 75.

[39]Elshal MF,McCoy JP. Multiplex bead array assays performance evaluation and comparison of sensitivity to ELISA[J].Methods,2006,38(4):317 - 323.

[40]JJF 1059 - 1999測量不確定度評定與表示[S]. 北京:中國計量出版社,2000.

[41]彭明婷,艾承錦,李臣賓,等. 氰化高鐵血紅蛋白國家一級標準物質的研制[J]. 中華檢驗醫學雜志,2009,32(1):97 - 101.

[42]Toussaint B,Emons H,Schimmel HG,etal. Traceability of values for catalytic activity concentration of enzymes:a certifed reference material for aspartate transaminase[J]. Clin. Chem. Lab. Med. 2010,48(6):795 - 803.