尋常型天皰瘡患者抗原特異性Th細胞的研究

董娟 王穎 朱海琴 許人超 鄭捷 潘萌

尋常型天皰瘡患者抗原特異性Th細胞的研究

董娟 王穎 朱海琴 許人超 鄭捷 潘萌

目的探討尋常型天皰瘡(pemphigus vulgaris,PV)患者抗原特異性Th1和Th2細胞在不同疾病階段的變化,進一步了解自身反應性T細胞在疾病中的作用。方法收集24例PV患者資料,合成橋粒芯糖蛋白抗原肽段DG3(96～112)。體外用該肽段分別刺激患者的外周血單一核細胞(PBMC),用酶聯免疫斑點(ELISPOT)方法檢測干擾素(IFN)-γ+Th1細胞和白介素(IL)-4+Th2細胞的數量,以及記憶性B細胞的數量。用t檢驗或單因素方差分析(one-way ANOVA)對各組數值進行比較,用Pearson相關系數對Th細胞、記憶性B細胞及抗橋粒芯糖蛋白3(Dsg3)抗體滴度進行相關性分析。結果24例PV患者男女比例1.67∶1,平均年齡(56.59±14.66)歲。5×105個PBMC中,PV患者特異性IFN-γ+Th1細胞絕對數為420.18±350.29,高于健康對照145.12±86.56,差異有統計學意義(P＜0.05)。PV患者特異性IL-4+Th2的細胞數(366.76±192.44)與健康對照(335.88±164.96)之間差異無統計學意義。PV患者外周血中特異性IL-4+Th2占總Th2細胞的百分率為37.03%±23.44%,特異性IFN-γ+Th1細胞為23.62%±16.77%;7例患者進行了治療前后的自身對照比較。特異性IL-4+Th2細胞的數量在治療后(241.68±160.60)較治療前(452.82±199.29)明顯下降,差異有統計學意義(t=2.48,P＜0.05)。特異性Th細胞、記憶性B細胞及抗Dsg3抗體滴度之間無統計學相關性(均P＞0.05)。結論抗原肽段DG3(96～112)含有被PV患者特異性Th細胞識別的致病性抗原表位;特異性IFN-γ+Th1細胞和IL-4+Th2細胞均在疾病中發揮一定的作用;特異性IL-4+Th2細胞在疾病活動中可能起到了更重要的致病作用。

天皰瘡;Th1細胞;Th2細胞;表位,T淋巴細胞;ELISPOT

尋常型天皰瘡(PV)是一種自身免疫性大皰性皮膚病,其自身抗原成分是角質形成細胞(KC)間橋粒結構中的橋粒芯糖蛋白3(desmoglein3,Dsg3)。對自身抗原免疫耐受的喪失是自身免疫病產生的前提條件,Th細胞與B細胞之間存在一種正反饋的相互調節作用［1］。已有多種研究對Dsg3特異性Th1及Th2細胞進行檢測［2-7］,但是研究方法的不同,所檢測的Th細胞類型及其所分泌的細胞因子也不盡相同。Lin等［2］研究發現PV患者外周血T細胞體外經Dsg3胞外肽段刺激后有增殖反應,主要是CD4+T細胞,產生白介素(IL)-1、IL-6等Th2類細胞因子。Veldman等［3］利用磁珠分選(MACS)方法在急性期、慢性活動期及緩解期PV患者外周血中均檢測到自身反應性干擾素(IFN)-γ+Th1及IL-4+Th2細胞,Th2細胞在不同疾病階段無差異,而Th1細胞主要出現在慢性活動期,抗體滴度與自身反應性Th1/Th2的比值直接相關。Rizzo等［4］發現,急性期患者外周血中特異性Th2細胞較緩解期明顯增多,但是Th1/Th2的比值與疾病活動度及抗體滴度無關。我們通過流式細胞儀發現患者中存在Th1與Th2的失衡,細胞免疫應答向Th2型偏移［5］。但該研究是對細胞在外周血中總的比例的分析,未進一步對抗原特異性的免疫活性細胞進行研究。為了更好地揭示活性Th細胞在疾病中的作用,本研究在前期工作的基礎上用酶聯免疫斑點(ELISPOT)方法在免疫活性細胞的水平對抗原特異性的自身反應性Th1、Th2細胞進行分析,并進一步明確這些免疫活性細胞在PV發病中的作用。

對象和方法

一、對象

1.PV患者及健康對照:24例我院收治的經臨床、組織病理、免疫熒光檢測確診的PV患者,均含有高滴度的抗Dsg3抗體。根據病程及治療情況,將所有患者分為3組,即未治療組、治療組和復發組。未治療組是指初發患者,未經過任何治療;治療組是指已接受系統糖皮質激素或其他免疫抑制劑治療;復發組是指病情穩定1個月以上,又出現新發皮損或黏膜損害。健康對照為10例健康體檢者。本研究經過醫院倫理委員會批準,患者均簽署知情同意書。治療前采集所有患者及健康對照外周血,治療后病情好轉時(注:患者大約每2周隨訪1次,隨訪時1周內無新發皮損,原有皮損逐漸愈合視為好轉,治療后平均約1個月)再次采集7例患者外周靜脈血,利用Ficoll淋巴細胞分離液分離出PBMC,暫時液氮中凍存備用。

2.肽段:根據文獻［8］,選取 Dsg3 抗原特異性肽段DG3(96～112),及對照肽段DG3(730～750),送上海吉爾生化公司合成。

3.主要試劑:IFN-γ/IL-4 precoated ELISPOT試劑盒購自北京達科為生物技術有限公司,人IgG B細胞ELISPOT試劑盒購自荷蘭U-CyTech biosciences,RPMI 1640細胞培養基、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司,96孔板購自美國Millipore公司。

二、方法

1.ELISPOT檢測PBMC中Th細胞:將凍存的細胞復蘇。在預包被板中加入200 μl/孔RPMI 1640培養基,室溫靜置10 min后將其移除,加入100 μl/孔的細胞懸液,使最終細胞數為0.5～2×105/孔。空白對照孔中不加任何處理因素,陽性對照孔中加入終濃度為20 mg/L的PHA,實驗孔內加入終濃度10 mg/L的肽段DG3(96～112)或DG3(730～750)。蓋好板蓋,于100%濕度、37℃ 5%CO2培養箱中培養20 h。1×洗滌緩沖液洗滌5次后,加入生物素標記的抗IFN-γ或IL-4的一抗工作液,100 μl/孔,37℃孵育1 h,洗滌后加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗工作液100 μl/孔,37℃孵育1 h,洗滌后加入3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)顯色液 100 μl/孔,室溫避光靜置15～45 min。終止顯色,置室溫陰涼處自然晾干,行斑點計數。

2.ELISPOT檢測PBMC中記憶性B細胞:用新鮮的含10%FBS的RPMI 1640培養基制備(0.5～2)×106/ml的細胞懸液,加入圓底48孔板中。空白對照孔中不加任何處理因素,陽性對照孔加入終濃度10 mg/L的B細胞刺激物,實驗孔加入終濃度10 mg/L的肽段DG3(96～112),混勻后置100%濕度、37℃5%CO2培養箱中5 d。收集培養板中的細胞,制備細胞懸液。在96孔millipore板中加入70%乙醇25 μl/孔,室溫放置1 min后將其移除,用PBS-I洗滌2次。加入包被抗體50 μl/孔,4℃孵育過夜。PBS-I洗滌3次后,加入1×封閉緩沖液R 200 μl/孔,37 ℃孵育 1 h。棄去孔內液體,加入 100 μl細胞懸液,使細胞數為(0.2～2)×105/孔,置100%濕度、37℃5%CO2培養箱中培養7 h。棄去孔內液體,用PBS-I溶液洗滌2次。用1×洗滌緩沖液洗滌5次,加入生物素標記的檢測抗體100 μl/孔,37℃孵育1 h。洗滌后加入辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素(streptavidin-HRP)溶液 100 μl/孔,37 ℃孵育1 h。洗滌后加入AEC底物溶液100 μl/孔,室溫避光孵育45 min,用去離子水沖洗,以終止顯色反應,置室溫下自然晾干,斑點計數。

3.統計學處理:用SPSS 13.0統計軟件對數據進行分析,數據用±s表示,各組間比較用t檢驗或單因素方差分析(one-way ANOVA)方法進行分析。用Pearson相關系數進行相關性分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

結 果

一、臨床資料

24例PV患者,男15例,女9例,男∶女為1.67∶1,發病年齡19～78歲,平均(56.59±14.66)歲,病程2個月至7年。根據病程及治療情況,將患者分為未治療組7例,治療組10例,復發組7例。各組之間年齡、性別差異均無統計學意義。

二、PBMC抗原特異性Th細胞的數目及比例

PBMC經肽段刺激培養后,Th1及Th2細胞分別被活化并分泌相應的細胞因子。如圖1所示,每個點代表一個產生相應細胞因子的細胞。PV患者及健康對照PBMC中均檢測到肽段DG3(96～112)特異性IFN-γ+Th1細胞和IL-4+Th2細胞。兩組均未檢測出肽段DG3(730～750)特異性細胞。

5×105個PBMC中,患者DG3(96～112)特異性IFN-γ+Th1細胞絕對數為420.18±350.29,高于健康對照組145.12±86.56,差異有統計學意義(t=3.25,P＜0.05);未治療組IFN-γ+Th1細胞絕對數為351.85±170.83,治療組為383.26±269.81,復發組為312.96±182.40,3組細胞數均較健康對照組明顯升高,但未治療組、治療組和復發組三者之間差異無統計學意義。PV患者特異性IL-4+Th2的細胞數為366.76±192.44,與健康對照(335.88±164.96)之間,差異無統計學意義(t=0.44,P＞0.05)。

圖1 干擾素(IFN)-γ+Th1細胞和白介素(IL)-4+Th2細胞的酶聯免疫斑點(ELISPOT)分析圖示 1a:空白對照;1b:產生IFN-γ的Th1細胞;1c:產生IL-4的Th2細胞

我們分析PV患者中特異性IFN-γ+Th1細胞和IL-4+Th2細胞各占總Th1和Th2細胞的百分比。患者特異性IL-4+Th2細胞的比例為37.03%±23.44%,特異性IFN-γ+Th1細胞比例為23.62% ±16.77%,差異有統計學意義(t=2.28,P＜0.05)。

7例患者進行了治療前后的自身對照比較,治療后病情較前均有所緩解。PV患者單位數量(5×105)PBMC中,DG3(96～112)特異性IFN-γ+Th1細胞的數量在治療前(483.00±409.01)與治療后(512.33±319.47)差異無統計學意義(t=0.17,P＞0.05);特異性IL-4+Th2細胞數量在治療后(241.68±160.60)較治療前(452.82±199.29)明顯下降,差異有統計學意義(t=2.48,P＜0.05)。

三、PBMC抗原特異性記憶性B細胞的數量

10例PV患者均檢測到DG3(96～112)特異性記憶性B細胞［(4.21～197.86)個/5×105PBMC)］,5例健康對照檢測到記憶性B細胞(＜20.00個/5×105PBMC),PV患者特異性記憶性B細胞數(83.70±63.90)較健康對照(12.03±18.81)有所升高,但差異無統計學意義(t=1.02,P＞0.05)。

四、免疫細胞及抗體滴度之間的相關性分析

對特異性IFN-γ+Th1細胞,IL-4+Th2細胞,記憶性B細胞,抗Dsg3抗體滴度四者之間的相關性進行分析。特異性IL-4+Th2細胞與抗Dsg3抗體滴度之間(R=0.376,P＞0.05),特異性Th1/Th2比值與抗Dsg3抗體滴度之間(R=0.114,P＞0.05),特異性Th細胞與記憶性B細胞之間(R=0.203,P＞0.05),記憶性B細胞與抗Dsg3抗體滴度之間(R=0.268,P＞0.05)相關性均無統計學意義。

討 論

在自身免疫性疾病中,免疫細胞對自身抗原免疫耐受的喪失是疾病產生的前提條件,最終引起細胞免疫或體液免疫應答,導致組織破壞［9］。目前,越來越多的研究發現,PV是一種主要以自身抗體發揮致病作用的疾病,而T細胞尤其是Th細胞在疾病的發生和發展中也起重要的作用［2，5-10］。Veldman 等［8］通過體外培養PV自身反應性T細胞,發現絕大部分T細胞克隆可識別肽段DG3(96～112),該肽段含有能被自身反應性T細胞識別的特殊結構。因此本文主要應用肽段DG3(96～112)檢測外周血特異性Th細胞。結果顯示PV患者外周血中存在DG3(96～112)特異性Th細胞,但未檢測到結構特性與其相似的胞內肽段DG3(730～750)特異性的Th1或Th2細胞,從而證實肽段DG3(96～112)是該病重要的致病位點,發揮免疫原性和免疫反應性。

有文獻報道,PV患者體內存在特異性Th1細胞和 Th2 細胞,兩者共同參與 PV 的發生和發展［3-4，11-12］。對于兩種細胞及其分泌的細胞因子在疾病發生發展中所起作用的大小,不同的研究結果不同。我們利用ELISPOT方法,在特異性活性細胞的水平,研究IFN-γ+Th1細胞和IL-4+Th2細胞在疾病中的作用。區別于免疫吸附法等其他手段,ELISPOT具有特異性高、靈敏度高的優勢。我們發現PV患者特異性IFN-γ+Th1細胞的數量較健康對照明顯升高,可能與皮損部位的炎癥反應有關。Th1細胞可輔助增強細胞毒性T細胞(Tc細胞)、巨噬細胞等的反應,參與誘導角質形成細胞凋亡等,而PV患者皮疹較重,可表現為大面積的糜爛滲出,伴有嚴重的炎癥反應,使主要介導炎癥反應的Th1細胞免疫應答增強。目前免疫學研究提示,IFN-γ+Th1亦可輔助自身反應性B細胞產生相應的抗體及其他炎癥因子［3，13-14］。我們的研究發現,雖然PV患者特異性IL-4+Th2細胞的絕對值和健康對照差異不大,進一步分析后發現此類細胞占總的IL-4+Th2細胞的百分比較高,高于特異性Th1細胞的百分比。另外,對部分患者進行治療前后的比較發現,特異性IL-4+Th2細胞在治療后明顯下降,進一步證明特異性Th2細胞在疾病中發揮重要的致病作用,而且與疾病的嚴重度相平行。但是,在相關性的分析中,無論是Th1細胞還是Th2細胞與記憶性B細胞及抗體滴度間均無明顯的相關性,究其原因,可能和樣本數量偏小有關,我們需要在今后的工作中積累更多的病例,進行深入研究。

綜上所述,在PV的發病過程中,特異性IFN-γ+Th1細胞和IL-4+Th2細胞發揮了不同的作用,而特異性IL-4+Th2細胞在疾病活動中可能起了重要的致病作用,其數值變化可作為指導治療、評判療效的重要指標。

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2013-01-05)

(本文編輯:尚淑賢)

Antigen-specific helper T cells in patients with pemphigus vulgaris

Dong Juan，Wang Ying，Zhu Haiqin，Xu Renchao，Zheng Jie，Pan Meng*.*Department of Dermatology，Ruijin Hospital，Shanghai Jiao Tong University School of Medicine，Shanghai 200025，China

Pan Meng，Email：panmeng@medmail.com.cn

ObjectiveTo study the changes of antigen-specific T helper type 1(Th1)cells and Th2 cells in patients with pemphigus vulgaris(PV)at different stages，so as to better understand the roles of autoreactive T cells in PV.MethodsThe DG3(96-112)peptide was synthesized.Twenty-four patients with PV and 10 health checkup examinees were included in this study.Peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)were obtained from the health checkup examinees and all the patients before treatment and seven patients about one month after treatment，and stimulated with the DG3 peptide of 10 mg/L for different durations.Then，enzyme-linked immunospot(ELISPOT)assay was performed to count the number of DG3-specific IFN-γ+Th1 cells，IL-4+Th2 cells and memory B cells.One-way analysis of variance(ANOVA)andttest were done to compare the number of cells between different groups，and Pearson correlation coefficient was used to evaluate the correlation among Th cells，memory B cells and anti-desmoglein 3(Dsg3)antibody titers.ResultsIn these patients，the male to female ratio was 1.67∶1，and the average age was(56.59 ± 14.66)years.Compared with the health check-up examinees，the patients with PV showed a higher absolute number of DG3-specific IFN-γ+Th1 cells(420.18 ± 350.29 vs.145.12 ±86.56，t=3.25，P＜ 0.05)，but a similar absolute number of specific IL-4+Th2 cells(366.76 ± 192.44 vs.335.88 ±164.96，P＞0.05)per 5×105PBMCs.The percentage of DG3-specific IL-4+Th2 cells in Th2 cells was 37.03% ±23.44%，and the percentage of IFN-γ+Th1 cells was 23.62% ± 16.77%in peripheral blood of patients with PV.The number of DG3-specific IL-4+Th2 cells per 5×105PBMCs significantly decreased from 452.82±199.29 before treatment to 241.68±160.60 after treatment in seven patients(t=2.48，P＜0.05).There was no significant correlation between specific Th cells，memory B cells and anti-Dsg3 antibody titers(allP＞ 0.05).ConclusionsThe peptide DG3(96-112)has pathogenic epitopes which could be recognized by specific Th cells of patients with PV.Both antigen-specific IFN-γ+Th1 cells and IL-4+Th2 cells play certain roles in the pathogenesis of pemphigus vulgaris，and IL-4+Th2 cells appear to be more important.

Pemphigus；Th1 cells；Th2 cells；Epitopes，T-lymphocyte；ELISPOT

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.01.004

國家自然科學基金(81171499);上海市科委基礎研究重點項目(10JC1410600)

200025上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院皮膚科［董娟(現在鄭州大學第一附屬醫院皮膚科,450052)、朱海琴、許人超、鄭捷、潘萌］;上海市免疫學研究所(王穎)

潘萌,Email:panmeng@medmail.com.cn