特應性皮炎患者外周血和皮損miR-155的表達及其與Th17細胞相關性研究

馬蕾 薛海波 管秀好 舒春梅 于娟 張俊花 運蓓蕾

特應性皮炎患者外周血和皮損miR-155的表達及其與Th17細胞相關性研究

馬蕾 薛海波 管秀好 舒春梅 于娟 張俊花 運蓓蕾

目的探討特應性皮炎(AD)患者外周血與皮損組織中miR-155、Th17細胞、Th17細胞特異性轉錄因子RORγt及效應性細胞因子IL-17的表達及其相關性。方法用實時熒光定量RT-PCR檢測37例AD患者外周血單一核細胞(PBMC)中miR-155、RORγt及IL-17的mRNA表達水平,流式細胞儀檢測Th17細胞比例,酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血漿中IL-17的含量;并以33例性別、年齡匹配的健康兒童做對照。檢測5例重度AD患者皮損與皮損周圍組織中miR-155、RORγt及IL-17 mRNA的表達水平,并以5例正常皮膚組織標本為對照。結果AD患者PBMC中miR-155、RORγt及IL-17的mRNA表達水平均明顯高于健康對照(分別為5.78±1.78比1.82±0.46,6.08±1.04比1.64±0.52,7.09±1.75比1.71±0.46,均P＜0.01);AD患者PBMC中Th17細胞比例及IL-17血漿含量均明顯高于健康對照,分別為(1.78±0.52)%比(0.47±0.15)%,(32.51±6.15)pg/ml比(11.80±2.24)pg/ml,均P ＜0.01。AD患者皮損、皮損周圍組織及正常皮膚組織中miR-155、RORγt及IL-17 mRNA表達水平間比較,差異均具有統計學意義;皮損＞皮損周圍組織＞正常皮膚組織,F值分別為41.803、17.040和37.064,均P＜0.01。AD患者PBMC中miR-155 mRNA表達水平與疾病嚴重程度評分、Th17細胞比例、RORγt mRNA表達水平、IL-17 mRNA表達水平及IL-17血漿含量呈正相關,r值分別為0.405、0.426、0.402、0.410、0.408,均P＜0.05;皮損及皮損周圍組織中miR-155 mRNA表達水平與RORγt、IL-17的mRNA表達水平呈正相關,r值分別為0.428和0.435,均P＜0.05。結論AD患者miR-155、Th17細胞及其效應性細胞因子高表達可能與AD發病有關。

皮炎,特應性;miR-155;Th17細胞

特應性皮炎(atopic dermatitis,AD)是一種炎癥性皮膚病,其病因及發病機制復雜。microRNA是一類內源性短序列、非編碼、具有調控功能的單鏈小分子RNA,存在于基因組的非編碼區,通過與目的基因mRNA的3'末端非翻譯區(3'untranslatedregion，3'UTR)互補結合,降解目的基因mRNA和(或)抑制目的基因mRNA分子的轉錄后翻譯,調節蛋白質生成,從而在多種自身免疫性疾病的發生、發展過程中起作用［1-2］。有學者［3］用微陣列芯片研究發現AD皮損存在44條microRNA表達失調,miR-155是明顯上調的microRNA之一,提示其在AD發病中可能起一定的作用,但具體機制尚未明確。本研究通過檢測AD患者外周血與皮損組織中miR-155、Th17細胞、Th17細胞特異性轉錄因子RORγt及其效應性細胞因子IL-17的表達水平,探討miR-155對AD患者Th17細胞的表達調控。

對象與方法

一、對象

AD患者37例(男21例,女16例),符合Williams診斷標準［4］,平均年齡(10.14 ± 3.60)歲;健康對照為33例健康體檢兒童(男18例,女15例),平均年齡(11.03±3.34)歲,兩組間性別、年齡差異無統計學意義。用SCORAD評分標準判斷AD疾病嚴重程度［5］,SCORAD評分平均值為31.89(16～51),其中中度AD(15≤SCORAD＜40)23例,重度AD(SCORAD≥40)14例。所有AD患者在入組前1周停用抗組胺藥及外用糖皮質激素、免疫抑制劑、免疫調節劑,6個月內未系統使用糖皮質激素及免疫相關制劑。本研究獲得醫院倫理委員會批準,入組者及其患兒監護人均簽署知情同意書。

二、方法

1.標本采集:晨空腹采集各組受試對象外周靜脈血7 ml,440×g離心分離血漿,Ficoll密度梯度離心法分離、獲取外周血單一核細胞(PBMC);手術切取5例重度AD患者丘疹性損害及皮損周圍組織,5例正常皮膚組織標本取自整形外科手術。標本于-70℃保存待檢。

2.實時定量 RT-PCR 檢測 miR-155、RORγt及IL-17的mRNA表達水平:用Trizol RNA提取試劑(美國Invitrogen公司)按說明書提取PBMC、皮損、皮損周圍組織及正常皮膚組織中總RNA,紫外分光光度儀測定其純度,吸光度值(A260/A280)在1.8～2.0之間為合格樣本。分別利用miR-155莖環引物(5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACT GGATACGACCCCTAT-3')、內參U6反轉錄引物(5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3')及oligo(dT),按M-MLV逆轉錄試劑盒(美國Invitrogen公司)說明書合成對應的cDNA。用SYBR green real-time PCR master mix(日本Toyobo公司),分別以U6和β肌動蛋白為內參照,引物序列見表1。在Rotor-Gene 3000實時PCR儀(澳大利亞Corvett Research公司) 進行miR-155、RORγt及IL-17的定量檢測。檢測數據用分析軟件(Rotor-Gene Real-Time Analysis Software 6.0)和雙標準曲線法進行分析。

3.流式細胞儀檢測外周血Th17細胞比例(CD4+IL17+T細胞/CD4+T細胞%):將PBMC在含10%胎牛血清的RPMI1640培養液(美國Gibco公司)中調整濃度至2×106細胞/ml,分別加入50 μg/L佛波酯(PMA)、1 mg/L鈣離子載體和10 mg/L布雷菲德菌素A(BFA,均購自美國Sigma公司),37℃、5%CO2條件下共刺激培養5 h;染色方法、步驟參考說明書進行(美國eBioscience公司)。首先細胞膜FITC-CD4單克隆抗體標記,透膜、固定后PE-IL17單克隆抗體胞內染色。用FACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司)檢測標本,winMDI 2.9軟件分析數據。

4.酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血漿中IL-17的含量:用美國RD公司IL-17 ELISA試劑盒,按照說明書的操作標準進行。

表1 目的基因及內參基因引物序列

結 果

一、AD患者和健康對照PBMC中miR-155、RORγt及IL-17 mRNA表達水平

1.目的基因(miR-155、RORγt及 IL-17)和內參基因(U6、β肌動蛋白)標準曲線直線擬合度良好,直線相關性好,可在較寬的范圍內進行定量分析;擴增動力曲線呈S型,重復表現一致,擴增結果理想;熔解曲線表現為單峰,表明擴增的特異性和重復性良好。

2.AD患者PBMC中miR-155、RORγt及IL-17 mRNA表達水平均顯著高于健康對照者,差異具有統計學意義,見表2。

二、AD患者和健康對照者PBMC中Th17細胞比例

AD患者PBMC中Th17細胞比例(1.78±0.52%)顯著高于健康對照(0.47±0.15%),差異具有統計學意義(t=14.583,P＜0.01),見圖1。

三、AD患者和健康對照血漿中IL-17含量

AD患者血漿中IL-17含量為32.51±6.15 pg/ml,顯著高于健康對照者(11.80±2.24 pg/ml),差異有統計學意義(t=19.102,P＜0.01)。

表2 AD患者和健康對照PBMC中miR155、RORγt及IL-17 mRNA表達水平比較

圖1 AD患者(1a)和健康對照者(1b)Th17細胞比例流式圖

表3 AD患者皮損、皮損周圍組織及正常皮膚組織中miR-155、RORγt及IL-17 mRNA表達水平比較

四、AD患者皮損、皮損周圍組織及正常皮膚組織中miR-155、RORγt及IL-17 mRNA表達水平

AD患者皮損、皮損周圍組織與正常皮膚組織間miR-155、RORγt及IL-17 mRNA表達水平比較,差異具有統計學意義,P＜0.01;各組間兩兩比較差異亦均具有統計學意義,P＜0.05。見表3。

五、相關性檢測

AD患者外周血miR-155 mRNA表達水平與SCORAD評分、Th17細胞比例、RORγt mRNA表達水平、IL-17 mRNA表達水平及IL-17血漿含量均呈正相關。SCORAD評分r=0.405,P=0.013;Th17細胞比例r=0.426,P=0.009;RORγt mRNA表達水平r=0.402,P=0.014;IL-17 mRNA表達水平r=0.410,P=0.012;血漿IL-17含量r=0.408,P=0.012。AD患者皮損及皮損周圍組織中miR-155 mRNA表達水平與RORγt mRNA表達水平(r=0.428,P=0.018)及IL-17 mRNA表達水平(r=0.435,P=0.016)均呈正相關。

討 論

Th17細胞是一組以分泌IL-17(IL-17A)為特點的CD4+T細胞亞群,其發現源于對實驗性自身免疫性腦脊髓炎以及膠原誘導關節炎的研究。本研究結果顯示,Th17細胞及其特異性轉錄因子RORγt、效應性細胞因子IL-17在AD患者外周血及皮損中均高水平表達,進一步說明Th17細胞在AD發生發展中發揮重要作用［6-7］。

miR-155是一種多功能的microRNA分子,國外學者在AD患者皮損microRNA表達譜的研究中發現,miR-155 呈明顯高表達［3］。本研究結果顯示,AD患者外周血、皮損及皮損周圍組織miR-155 mRNA表達水平明顯增高,且外周血中miR-155 mRNA表達水平與疾病嚴重程度評分呈正相關,表明miR-155參與AD的疾病發生過程,miR-155表達水平可能成為AD的一個新型生物標志物。miR-155已被證實能夠明顯影響先天性免疫和適應性免疫過程,如炎癥介導、抗原提呈、T細胞分化、細胞因子產生等［8-9］。miR-155為Th17細胞分化所必需,缺失miR-155的T細胞不能正常分化為Th17細胞;miR-155基因敲除小鼠Th17細胞數量減少,且不發生EAE［8］。進一步研究表明,SOCS1(細胞因子信號抑制物1)是miR-155的直接靶基因,miR-155能夠通過JAK/STAT信號途徑抑制SOCS1的表達,進而促進小鼠CD4+T細胞中Th17細胞的分化與功能,RORγt及IL-17的表達均明顯增加［10］。經TargetScan軟件預測,SOCS1亦是人miR-155的特異性靶基因。在AD疾病狀態下,miR-155是否同樣能夠促進Th17細胞的分化與功能尚不清楚。本研究結果表明,AD患者外周血中miR-155 mRNA表達水平與Th17細胞比例、RORγt及IL-17的mRNA表達水平、IL-17血漿含量均呈正相關,皮損及皮損周圍組織中miR-155 mRNA表達水平亦與RORγt及IL-17的mRNA表達水平呈正相關,提示在AD疾病過程中高表達的miR-155可能通過促進Th17細胞的分化及其功能,增強Th17細胞的致炎作用,促發和加重皮損的炎癥反應,miR-155可能成為AD治療的一個新靶點。

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［7］馬蕾，薛海波，管秀好，等.特應性皮炎患者外周血CD4+T細胞亞群比例變化的研究［J］.中華微生物學和免疫學雜志，2012，32(4)：331-332.

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2013-05-27)

(本文編輯:吳曉初)

Expression of miR-155 in peripheral blood and skin lesions from as well as its relationship with Th17 cells in patients with atopic dermatitis

Ma Lei*，Xue Haibo，Guan Xiuhao，Shu Chunmei，Yu Juan，Zhang Junhua，Yun Beilei.*Department of Dermatology，Affiliated Hospital of Binzhou Medical University，Binzhou 256603，Shandong，China

Xue Haibo，Email：xuehaibo@sina.com

ObjectiveTo detect the expressions of miR-155，T helper type 17(Th17)cells，and Th17 cellspecific transcription factor RORγt and effector cytokine interleukin(IL)-17 in peripheral blood and skin lesions from，and to evaluate their relationship in，patients with atopic dermatitis(AD).MethodsPeripheral blood was obtained from 37 patients with AD and 33 age-and sex-matched healthy controls，and biopsy specimens from the lesional and perilesional skin of five patients with severe AD as well as from the normal skin of five healthy human controls.Real-time fluorescence-based reverse transcription(RT)-PCR was employed to measure the mRNA expression levels of miR-155，RORγt and IL-17 in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)and skin specimens，flow cytometry to detect the percentage of Th17 cells in PBMCs，enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)to determine the plasma concentration of IL-17.Statistical analysis was done using independent sample's ttest，one-way analysis of variance followed by the least significant difference test，and linear correlation analysis.ResultsCompared with the healthy controls，the patients with AD showed a significant increase in Th17 cell percentage(1.78% ±0.52%vs.0.47% ±0.15%，P＜0.01)，mRNA expression levels of miR-155(5.78±1.78 vs.1.82±0.46，P＜0.01)，RORγt(6.08±1.04 vs.1.64±0.52，P＜0.01)and IL-17(7.09±1.75 vs.1.71±0.46，P＜0.01)，as well as in the plasma concentration of IL-17((2.51±6.15)pg/ml vs.(11.80±2.24)pg/ml，P＜0.01).There was a sequential decrease in the expression levels of miR-155，RORγt and IL-17 mRNA from lesional skin，perilesional skin to normal skin(F=41.803，17.040 and 37.064 respectively，allP ＜ 0.01).The miR-155 mRNA expression level in PBMCs was positively correlated with the SCORing Atopic Dermatitis(SCORAD)index，Th17 cell percentage，RORγt and IL-17 mRNA expression levels as well as IL-17 plasma concentration(r=0.405，0.426，0.402，0.410 and 0.408 respectively，allP ＜ 0.05).Similarly，the miR-155 expression level was positively correlated with RORγt and IL-17 mRNA expression levels in lesional and paralesional specimens(r=0.428 and 0.435 respectively，bothP ＜ 0.05).ConclusionThe up-regulated expression of miR-155，Th17 cells and their effector cytokine IL-17 may be associated with the development of AD.

Dermatitis，atopic；miR-155；Th17 cells

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.01.005

山東省科技發展計劃(2011YD18069);山東省自然科學基金(ZR2010HQ013);山東省高等學校科技計劃(J10LF90);山東省醫藥衛生科技發展計劃(2011QZ003);濱州市科技發展計劃(2011ZC0914)

256603山東,濱州醫學院附屬醫院皮膚科(馬蕾、舒春梅、于娟、張俊花)，臨床學院(薛海波);中國醫科大學附屬第一醫院(管秀好);沈陽市第七人民醫院(運蓓蕾)

薛海波,Email:xuehaibo@sina.com