Peutz-Jeghers綜合征STK11基因突變研究

王昌媛 劉華 宗金寶 劉世國 史同新

Peutz-Jeghers綜合征STK11基因突變研究

王昌媛 劉華 宗金寶 劉世國 史同新

目的探討Peutz-Jeghers綜合征(PJS)STK11基因突變情況,為該病基因診斷及遺傳咨詢提供依據。方法收集PJS 1個家系(2例患者)及1例散發病例,3例患者均有典型的皮膚黏膜黑褐斑和消化道多發息肉,提取PJS家系中2例患者、6名健康親屬及1例散發病例、100例健康對照的外周血基因組DNA,PCR擴增STK11基因的9個外顯子及臨近的內含子,對PCR結果進行DNA直接測序,測序結果與基因庫中的STK11基因序列進行比對。結果家系中2例患者及1例散發患者STK11基因的9個外顯子及臨近內含子所有堿基未發現任何突變,家系中健康親屬及100例健康對照的STK11基因未發現突變。結論PJS存在遺傳異質性,可能存在新的位點和致病基因。

Peutz-Jeghers綜合征;基因,STK11;突變

Peutz-Jeghers綜合征(PJS)又稱黑斑息肉綜合征(OMIM#175200)是一種少見的常染色體顯性遺傳性疾病,以消化道多發錯構瘤性息肉、口唇黏膜黑褐色斑及惡性腫瘤高發為主要特征。其息肉可發生在消化道任何部位,以腸道為主,早期比較隱蔽,臨床上常在反復出現陣發性腹痛、消化道出血、腸梗阻等嚴重并發癥后才得以確診,給患者帶來極大痛苦。黑褐色斑亦可發生于面部、手足、口腔內及外生殖器等部位皮膚黏膜,影響患者美觀。調查發現PJS患者消化道及消化道外腫瘤的發生率顯著增高,約為普通人群的9～18倍,患者一生中各種癌癥累積風險為 93%［1］。1998年 Hemminki和 Jenne等研究證實,位于19p13.3的STK11基因(NG_007460,又稱LKB1基因)是PJS重要的致病基因［2-3］。目前在人類基因突變數據庫(human gene mutation database,HGMD)中已鑒定出的STK11基因致病突變共有200多種,但以往研究表明,部分PJS患者檢測不到該基因的突變［4］。本研究通過DNA測序的方法對收集的1個PJS家系及1例散發的PJS病例進行基因突變檢測,以期發現是否存在STK11基因的致病突變。

對象與方法

一、臨床資料

圖1 家系圖

圖2 先證者的臨床表現 2a:口腔內黏膜黑褐色斑;2b:手指末端散在分布5 mm大小黑褐色斑;2c:胃鏡顯示胃體部息肉

圖3 散發病例的臨床表現 3a:患者唇部散在分布1～2 mm大小黑褐色斑;3b:腸鏡顯示的腸道息肉

收集的1個PJS家系(圖1)共3代9人,患者3例。先證者,女,35歲,2歲時家長發現口唇出現針尖大小的黑褐色斑點,并逐漸累及口腔黏膜和手指末端,黑褐色斑無季節變化,無明顯自覺癥狀。患者近5年出現間斷性腹痛、便血,1年前行胃鏡、結腸鏡等檢查顯示胃、十二指腸、結腸多發性息肉,組織病理示增生性息肉,經內鏡切除部分息肉后,腹痛、便血等癥狀減輕。皮膚科檢查見唇部、口腔內黏膜及手指末端散在1 mm至5 mm大小黑褐色斑,手指末端的黑褐色斑數量少,但單個面積較大(圖2)。先證者的父母非近親結婚,父親已去世(死因不詳),先證者回憶其父口唇部有黑褐色斑點,先證者育有1女1子,女兒7歲,2歲時口唇出現類似黑褐色斑,目前未出現胃腸道癥狀,兒子3歲,皮膚黏膜未發現黑斑。收集的1例散發病例,女,28歲,1歲時發現口唇出現黑褐色斑,后累及雙手手指(圖3)。1年前出現腹痛、便血,3個月前在消化內科住院,行胃鏡、腸鏡及組織病理檢查示消化道多發性腺瘤樣息肉并部分切除。健康對照組來自青島大學醫學院附屬醫院山東省代謝性疾病重點實驗室保存的100例健康人外周血。本研究經過醫院倫理委員會批準,患者簽署知情同意書。

二、方法

1.外周血DNA的提取:抽取家系中2例患者、6例健康親屬及1例散發病例的靜脈抗凝血各5 ml,用Tiangen產DNA提取試劑盒(離心柱型)提取患者與健康對照的基因組DNA。利用Nanodrop2000微量紫外分光光度計(Thermo Scientific)對提取的DNA進行純度和濃度檢測。

2.PCR擴增:用Primer Premer5軟件設計引物擴增STK11基因第1～9外顯子,由北京Invitrogen公司合成引物。PCR反應體系為25 μl,包括2×Power Taq PCR Master Mix 12.5 μl、上下游引物(10 μmol/L)各1 μl、DNA 模板(50 ng/μl)2 μl、滅菌雙蒸水 8.5 μl。PCR參數:94℃預變性5 min,94℃變性30 s,60℃～68℃退火30 s(表1),72℃延伸45 s,進行35個循環后72℃延伸10 min,再逐漸降至4℃。

3.PCR擴增產物測序:PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離,利用UVP凝膠成像儀進行圖像掃描,于相應位置處見單一條帶。PCR產物送至上海申速生物有限公司進行直接測序。

表1 PCR引物序列及擴增片段長度及退火溫度

結 果

一、PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果

STK11基因全部外顯子經PCR擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定,在相應分子量位置擴增條帶其產物片段大小與預期相符(圖4),清晰單一,特異性良好,進行DNA測序。

二、STK11基因全部外顯子DNA測序結果

測序結果與STK11基因的正常序列進行比對分析(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/),家系中 2 例患者及1例散發患者STK11基因的9個外顯子及鄰近內含子的DNA序列均未發現任何堿基的突變。家系中6例健康親屬及100例健康對照者STK11基因的9個所有外顯子及鄰近內含子的DNA序列未發現任何堿基的突變。

討 論

研究選取的所有患者均經過皮膚科和消化內科醫師的確診,符合2010年消化系統腫瘤WHO分類中推薦的PJS診斷標準:①組織學上證實PJ息肉≥3個;②有PJS家族史,且出現PJ息肉(不管數量多少);③存在典型而顯著的皮膚黏膜色素沉著,并有PJS家族史;④任何數量的PJ息肉并且有顯著的皮膚黏膜色素沉著(符合以上任何一條標準即可診斷)。國外研究資料統計,有家族史的PJS患者STK11基因突變的檢出率為70%～80%,散發病例檢出率為25%［5］,認為PJS存在遺傳異質性,可能存在新的位點和致病基因。文獻顯示中國人PJS患者的STK11基因突變率更低,約占33.3%［6］。本研究中PJS家系中2例患者及1例散發病例均未檢測出STK11基因的所有外顯子及鄰近內含子的突變,也進一步證實了這一現象。STK11基因編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,是一種抑癌基因,包含3個主要區域,N端催化區域激酶、激酶催化區域和C端調節區域。

圖4 PCR結果 M:標準參照物;1～9:STK11基因9個外顯子

分析一部分PJS患者檢測不到的原因可能為:①PJS存在遺傳異質性,有待研究發現新的位點,克隆新的致病基因。2004年Jiang等［7］對10個無STK11基因突變的PJS家系進行了STK13的基因研究,但未檢測到致病的基因突變。下一步我們可以收集無STK11基因突變的較大的PJS家系進行連鎖分析,尋找新的致病位點;②STK11基因的致病突變位點不在外顯子區域,而在包含啟動子的非編碼序列。易鑫等［8］對15個來自不同家系的PJS患者進行了STK11基因啟動子-1160至-1543區間的突變分析,發現一SNP位點(-1275)G→T,認為是PJS的易感因素,但沒有大樣本數據的驗證;③STK11基因表達調控的過程中出現異常,2010年康曉靜等在一PJS家系中發現息肉組織STK11基因外顯子8的一個新的雜合突變,而在患者外周血中未發現此突變［4］;④PJS患者的STK11基因存在大片段的缺失,應用常規的基因測序方法無法檢測出。Volikos等用多重連接探針擴增技術(Multiplex Ligation dependent Probe Amplification，MLPA) 檢測常規測序方法未發現STK11基因突變的PJS患者,發現STK11基因種系突變率大約為80%,遠高于常規測序方法的檢出率［9］。

盡管已經對PJS的基因進行了深入研究,但因為其致病基因的復雜性,還需要收集更多的樣本對上述原因展開進一步的研究。

［1］van Lier MG，Westerman AM，Wagner A，et al.High cancer risk and increased mortality in patients with Peutz-Jeghers syndrome［J］.Gut，2011，60：141-147.

［2］Hemminki A，Markie D，Tomlinson I，et al.A serine/threonine kinase gene defective in Peutz-Jeghers syndrome ［J］.Nature，1998，391：184-187.

［3］Jenne DE，Reimann H，Nezu J，et al.Peutz-Jeghers syndrome is caused by mutations in a novel serine threonine kinase［J］.Nat Genet，1998，18：38-43.

［4］康曉靜，田艷，高峰，等.Peutz-Jeghers綜合征STK11基因突變研究［J］.中華皮膚科雜志，2010，43(4)：263-265.

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［6］李宜雄，呂新生，夏家輝，等.STK11基因突變在中國人Peutz-Jeghers綜合征中的特征［J］.中華醫學遺傳學雜志，2001，18(1)：4-7.

［7］Jiang JG，Li YX，Xia JH，et al.STK13 gene mutation in Chinese Patients with Peutz-Jeghers syndrome［J］.Chin J Dig，2004，24：583-585.

［8］Yi X，Yao MJ，Wang YJ，et al.Sequence polymorphism of the promoter region of gene STK11 in patients with Peutz-Jeghers syndrome［J］.Zhong Nan Da Xue Xue Bao(Yi Xue Ban)，2007，32(1)：74-77.

［9］Volikos E，Robinson J，Aittom?ki K，et al.LKB1 exonic and whole gene deletions are a common cause of Peutz-Jeghers syndrome［J］.J Med Genet，2006，43(5)：e18.

2013-03-05)

(本文編輯:吳曉初)

Mutation analysis of STK11 gene in patients with Peutz-Jeghers syndrome

Wang Changyuan*，Liu Hua，Zong Jinbao，Liu Shiguo，Shi Tongxin.*Department of Dermatology，Qingdao Municipal Hospital，Qingdao 266011，China

Shi Tongxin，Email：shitx2006@163.com

ObjectiveTo study the mutation of STK11 gene in a Chinese family and a sporadic patient with Peutz-Jeghers syndrome(PJS)，and to provide a basis for genetic diagnosis and counseling.MethodsOne sporadic patient and two patients from a family with PJS were collected，all of whom had typical mucosal pigmentation and gastrointestinal polyposis.Blood samples were obtained from the two patients and six unaffected relatives in this family，the sporadic patient，and 100 healthy controls.DNA was extracted，and PCR was performed to amplify nine exons and their adjacent introns in the STK11 gene followed by direct sequencing.The sequencing results were aligned to the published sequence of STK11 gene from Genbank.ResultsNo mutation was found in the STK11 gene of any of the patients，unaffected relatives，or healthy controls.ConclusionsGenetic heterogeneity exists in Peutz-Jeghers syndrome，hinting that there may be other causative genes or sites for this entity.

Peutz-Jeghers syndrome；Gene，STK11；Mutation

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.01.012

青島市衛生科技計劃(2010-ws20011)

266011青島市市立醫院皮膚科(王昌媛、史同新);青島大學醫學院附屬醫院消化內科(劉華);青島大學醫學院附屬醫院檢驗科(宗金寶),山東省代謝性疾病重點實驗室(劉世國)

史同新,Email:shitx2006@163.com