AZD8055抑制肝癌huh7細胞增殖和促細胞凋亡

李 鵬，王亞紅，楊拉維，楊 騰，何香紅，黃海麗

(廣東醫學院 附屬醫院 臨床醫學研究中心， 廣東 湛江 524001)

研究論文

AZD8055抑制肝癌huh7細胞增殖和促細胞凋亡

李 鵬，王亞紅，楊拉維，楊 騰，何香紅，黃海麗*

(廣東醫學院 附屬醫院 臨床醫學研究中心， 廣東 湛江 524001)

目的探討AZD8055對肝癌細胞增殖和克隆形成能力的影響及其分子機制。方法肝癌細胞系huh7隨機分為對照組(DMSO)和加藥組(AZD8055)，MTT法檢測huh7細胞增殖，平板克隆實驗檢測肝癌細胞克隆形成能力，AnexinV/FITC雙染法檢測細胞凋亡率，免疫印跡法檢測AMPK蛋白表達和磷酸化水平。結果AZD8055抑制肝癌細胞的增殖呈濃度和時間依賴性(Plt;0.05)。AZD8055處理導致肝癌細胞克隆數目減少以及誘導細胞發生凋亡(Plt;0.05)。AZD8055處理引起AMPK蛋白磷酸化水平上升，但對總蛋白表達水平影響不大。AMPK蛋白抑制劑Dorsomorphin通過抑制AMPK蛋白磷酸化水平而降低AZD8055對肝癌細胞的抑制作用。結論AZD8055可以抑制肝癌細胞的增殖和克隆形成能力，并且主要通過調節AMPK蛋白的磷酸化水平實現其對增殖的抑制作用。

AZD8055；肝癌；AMPK；增殖

AZD8055 是一種特異有效的雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)激酶抑制劑，它可以有效抑制mTORC1和mTORC2的活性[1- 2]。AZD8055與絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)胞外信號調節激酶(又稱AZD6224)協同作用，通過抑制MAPK和AKT/mTOR信號通路,從而提高非小細胞肺癌以及結腸直腸癌腫瘤細胞的凋亡率和生長抑制率[3]。AZD8055可以抑制乳腺癌細胞MCF7、骨肉瘤細胞U2OS、人惡性膠質母細胞瘤細胞U87MG的增殖。它主要通過抑制mTORC1和mTORC2的活性以及其下游的通路關鍵蛋白的活化實現對這些腫瘤細胞的抑制作用[4]。另外，還有研究表明,AZD8055對宮頸癌、急性淋巴白血病等腫瘤細胞均有抑制作用[2,5]。這些研究均顯示了AZD8055作為化療藥物治療腫瘤的潛力[6- 7]。

單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)是一個細胞能量狀態的生物感應器，已被證明對于腫瘤細胞的生長、代謝、凋亡和自噬具有調節作用[8]。AMPK對于腫瘤細胞具有雙重調節作用。AMPK通過間接調節NADPH促進癌細胞的生存[9- 10]。AMPK還可以調控癌細胞代謝，并限制癌細胞生長[11]。另外，AMPK在已知的腫瘤抑制基因的上游和下游發揮作用[8,12]。由于AMPK信號通路在腫瘤生長代謝等方面具有重要作用，本研究在探討AZD8055對肝癌細胞增殖抑制作用的分子機制時，將重點放在AMPK信號通路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系：huh7細胞為本實驗保存。

1.1.2 主要試劑：AZD8055(Selleck Chemicals公司)，AMPK抑制劑(dorsomorphin)、噻唑鹽MTT和二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司)，兔抗人p-AMPK和兔抗人AMPK抗體(Cell Signaling Technology公司)，兔抗人Actin(Santa Cruze Biotechnology公司)，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(武漢博士德生物)，PVDF膜(Millipore公司)，Annexin V-FITC/PI檢測試劑盒(BD公司)，RPMI-1640培養基，胎牛血清(Life technology公司)，BCA蛋白定量試劑盒(碧云天生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：將huh7細胞培養于含10% 胎牛血清1640 培養基內，37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養。

1.2.2 MTT實驗：取對數增殖期細胞接種于96 孔板, 每孔200 μL濃度為1×107cells/L, 過夜培養等細胞貼壁后加入不同劑量梯度(5、10、20、50和100 nmol/L)和不同作用時間(12、24、36、48和72 h)的AZD8055試劑，對照組加入等體積的DMSO試劑，分別處理huh7細胞，每組設6個平行孔。實驗終止前4 h，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，培養結束后小心吸棄孔內培養上清液，加入DMSO 150 μL，完全顯色后，在酶聯免疫檢測儀上選擇490 nm波長測定各孔光吸收值。按公式計算AZD8055對huh7細胞的生長抑制率(%)=(1-實驗組A490值/對照組A490值)×100%

1.2.3 平板克隆形成實驗：取對數生長期的huh7細胞，經0.25%胰蛋白酶消化后吹打成單個懸浮細胞，血球計數板計數后以每孔150個/mL細胞接種于6孔板中，每孔加入2 mL細胞懸液，每個平行設2個復孔，待細胞貼壁后，按照100 nmol/L AZD8055進行實驗處理(DMSO組作為陰性對照組)，置37 ℃、5% CO2及飽和濕度環境下，靜置培養2周，當培養皿中出現肉眼可見的克隆時，終止培養，棄去上清液，用PBS小心漂洗2次，甲醇固定，然后進行結晶紫活細胞染色30 min，用流水緩慢漂洗去除染色液，自然風干。觀察細胞克隆形成。此實驗重復3次。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI檢測細胞凋亡：取對數生長期細胞接種于6孔板, 每孔2 mL濃度為2×108cells/L, 過夜培養等細胞貼壁后加入100 nmol/L的AZD8055，對照組加入等體積DMSO，分組處理huh7細胞24 h，收集細胞樣品，PBS洗滌。按 Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書處理細胞樣品，上機檢測。

1.2.5 Western blot檢測p-AMPK、AMPK蛋白表達量的變化：取對數生長期huh7細胞接種于培養板，待細胞貼壁后，換含2%胎牛血清的1640培養基培養10～12 h，加入100 nmol/L AZD8055作用不同時間梯度(0、6、12和24 h)，或預先加入AMPK抑制劑2 mmol/L dorsomorphin處理2 h再加入100 nmol/L AZD8055作用12 h，對照組加入等體積的二甲基亞砜(DMSO)。收集細胞，用預冷PBS洗滌1次，蛋白裂解液(RIPA)裂解細胞，離心收集上清液即為總蛋白溶液。BCA法測定蛋白含量，取等量蛋白進行SDS-PAGE電泳，電泳后將膠轉移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，再將膜置于5%脫脂奶粉的TBST封閉液中封閉1 h，一抗孵育4 ℃過夜，TBST洗膜，用相應的辣根過氧化物酶標記的二抗常溫孵育1 h，TBST 洗膜后，ECL顯色發光檢測相應條帶。β-actin 作為內參照。所有實驗至少重復3 次。

1.2.6 臺盼藍染色檢測細胞活力：按照預定的實驗分組進行實驗處理，細胞消化成單細胞懸液，采用0.4%臺盼藍染色并細胞計數，死細胞為藍紫色，活細胞為透明色，重復3次，取平均值，計算細胞活力抑制率。活細胞率(%)= 活細胞總數/(活細胞總數+死細胞總數)×100%

2 結果

2.1 AZD8055對huh7細胞增殖的抑制作用

AZD8055抑制huh7細胞的增殖并呈現明顯的劑量和時間依賴性(圖1)。

2.2AZD8055對huh7細胞克隆形成能力的影響

AZD8055抑制huh7細胞克隆形成能力(圖2)。

2.3 AZD8055對huh7細胞凋亡的影響

和對照組相比，AZD8055(100 nmol/L)處理huh7細胞24和48 h后，凋亡率有明顯上升，其中早期凋亡率分別達到13.0%和19.0%，晚期凋亡率分別達到15.6%和22.5%(Plt;0.05)(圖3)。

2.4AZD8055抑制huh7細胞增殖通過激活AMPK活性

100 nmol/L AZD8055引起了AMPK蛋白磷酸化水平的升高并在24 h時達到最高水平(圖4A)，而預先加入AMPK抑制劑dorsomorphin處理 2 h再加入100 nmol/L AZD8055處理，減弱了AMPK蛋白磷酸化水平的升高(圖4B)。臺盼藍染色檢測細胞活力實驗同樣證實加入AMPK抑制劑dorsomorphin減弱了AZD8055對huh7細胞凋亡的影響(圖4C)。

*Plt;0.05，**Plt;0.01 compared with control 圖1 AZD8055對huh7細胞增殖的抑制作用Fig 1 The proliferation inhibition by AZD8055 on huh7 cells

*Plt;0.01 compared with control圖2 AZD8055抑制huh7細胞克隆形成Fig 2 AZD8055 suppresses colony formation of huh7 cells

*Plt;0.05 compared with control 圖3 流式細胞術檢測細胞凋亡Fig 3 Apoptosis analyzed by flow cytometry

A.AZD8055 increased p-AMPK expression without changing AMPK expression; B.AMPK inhibitor dorsomorphin compromised AZD8055-induced up-regulation of p-AMPK; C.death rate of huh7 following different treatment; *Plt;0.05, **Plt;0.01 compared with control; #Plt;0.05 compared with or without dorsomorphin圖4 AZD8055抑制huh7細胞增殖通過激活AMPK活性Fig 4 Role of AMPK activation in AZD8055-induced huh7 cells death

3 討論

肝癌是中國死亡率最高的癌癥之一。目前中國肝癌的治療手段以手術為主，而不能手術的患者則以化療為主。目前常用的化療藥物存在著易產生耐藥性、腫瘤殺傷效率不高等局限，因此迫切需要開發新的有效藥物治療肝癌。

AZD8055是一種特異有效的mTOR抑制劑[1,4]。細胞和動物實驗結果表明，它對于肺癌、乳腺癌、大腸癌和黑色素瘤等多種腫瘤細胞的增殖能力均有抑制作用[2- 3]。本實驗主要研究其對肝癌細胞增殖、克隆形成能力的影響以及相關分子機制。本結果顯示AZD8055可以抑制肝癌細胞的增殖能力，并且這種抑制作用具有時間和濃度依賴性。另外，AZD8055還可以抑制肝癌細胞的克隆形成能力，誘導肝癌細胞發生凋亡。因此推測AZD8055通過誘導肝癌細胞凋亡從而抑制其增殖。

單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated potein kinase，AMPK)具有細胞能量調節器的功能，當細胞經歷代謝應激反應時(例如化療藥物的刺激)，伴隨著細胞內AMP水平或AMP與ATP的比例升高，AMPK被AMP激活，其活化的結果導致脂肪酸氧化的增加以產生更多ATP；同時抑制ATP消耗，幫助細胞度過急性損傷，暫時保障細胞的存活[9,13]。前人研究表明，AMPK通路對于化療后腫瘤細胞的生存具有關鍵作用，它可以調節腫瘤細胞的代謝以及生長速度[14]。本研究發現AZD8055處理引起肝癌細胞激活AMPK信號通路，AMPK蛋白磷酸化水平升高。而抑制AMPK信號通路的激活則可部分扭轉AZD8055對肝癌細胞的增殖抑制作用。這些結果表明AZD8055通過激活AMPK通路從而調節肝癌細胞的增殖。

綜上所述，AZD8055可以抑制肝癌細胞的增殖和克隆形成能力，其對肝癌細胞的抑制作用主要是通過調節AMPK信號通路的活化來實現的。這為應用AZD8055治療肝癌提供了理論依據。

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AZD8055 inhibits proliferation andinduces apoptosis of hepatocellular carcinoma huh7 cells

LI Peng, WANG Ya-hong, YANG La-wei, YANG Teng, HE Xiang-hong, HUANG Hai-li*

(Clinical Research Center, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524001, China)

ObjectiveTo investigate effects of AZD8055 on proliferation and colony formation of hepatocellular carcinoma cells.MethodsThe huh7 cells were divided into two groups: control group (DMSO) and AZD8055 group. MTT assay and colony formation assay were performed to detect effects of AZD8055 on proliferation and colony formation of hepatocellular carcinoma cells respectively. Apoptosis rate was assessed by performing AnexinV/FITC double staining. Western blot was performed to detect AMPK and p-AMPK expression.ResultsAZD8055 inhibited proliferation of huh7 cells in a time- and concentration-dependent manner (Plt;0.05). AZD8055 treatment reduced colony numbers of huh7 cells and induced apoptosis compared to those untreated cells (Plt;0.05). AZD8055 treatment increased p-AMPK expression but didn’t change AMPK expression. Blocking AMPK activation by using AMPK inhibitor Dorsomorphin partially reversed proliferation inhibition induced by AZD8055.ConclusionsAZD8055 inhibits proliferation and colony formation of huh7 cells through AMPK signaling pathway.

AZD8055; hepatocellular carcinoma; AMPK; proliferation

2013- 12- 24

2014- 03- 24

廣東省自然科學基金博士啟動項目(S2012040006537)；廣東醫學院附屬醫院博士科研基金(BK201202)；廣東醫學院博士啟動項目(XB1224)

*通信作者(correspondingauthor)：huanghaili2013@126.com

1001-6325(2014)06-0771-05

R73-36+2

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