mRNA電轉抗CD3抗體刺激的PBMC方法的建立

胡 愉，趙 慧,2，王 準，何 維*

(1.中國醫學科學院 基礎醫學研究所 北京協和醫學院 基礎學院 免疫學系 醫學分子生物學國家重點實驗室，北京 100005； 2.中國食品藥品檢定研究院 病毒三室， 北京 100050)

研究論文

mRNA電轉抗CD3抗體刺激的PBMC方法的建立

胡 愉1，趙 慧1,2，王 準1，何 維1*

(1.中國醫學科學院 基礎醫學研究所 北京協和醫學院 基礎學院 免疫學系 醫學分子生物學國家重點實驗室，
北京 100005； 2.中國食品藥品檢定研究院 病毒三室， 北京 100050)

目的建立信使RNA(mRNA)電轉抗CD3抗體刺激的外周血單個核細胞(PBMC)的方法，為制備基因修飾CDR3δ移植型γδ T淋巴細胞，為腫瘤細胞過繼治療提供新的技術方法。方法以SpeⅠ內切酶消化重組pGEM4Z/EGFP/A64質粒，回收純化線性化的重組質粒pGEM4Z/EGFP/A64，體外轉錄成mRNA；在電轉參數為500 V 500 μs、400 V 500 μs或300 V 500 μs等不同條件下，轉染抗CD3抗體刺激的人PBMC；用倒置熒光顯微鏡觀察和流式細胞儀觀察和分析綠色熒光蛋白的表達；臺盼藍染色計算不同電轉條件下細胞的存活率，以確定mRNA電轉最佳條件。結果pGEM4Z/EGFP/A64質粒經過SpeⅠ內切酶酶切，獲得了線性化的質粒；體外轉錄得到了增強型綠色熒光蛋白(EGFP)mRNA； 與其他轉染條件相比，在500 V 500 μs電轉參數下轉染EGFPmRNA的PBMC細胞，電轉后48 h綠色熒光蛋白表達量較高；與其他轉染條件相比，在500 V 500 μs電轉參數下轉染EGFPmRNA的PBMC細胞，電轉48 h后綠色熒光蛋白表達的陽性細胞高達77%；臺盼藍染色分析不同電轉條件下細胞的存活率，在細胞電轉48 h后，500 V 500 μs參數電轉條件下細胞存活率可以達到85%以上。結論電轉參數為500 V 500 μs的條件可用于電轉mRNA于抗CD3抗體擴增的人PBMC，以制備基因修飾T淋巴細胞。

信使RNA；電轉；外周血單個核細胞；加強型綠色熒光蛋白

γδT細胞獨特的抗原識別模式及其廣譜的腫瘤殺傷活性已使其成為深受人們關注的腫瘤過繼免疫治療的候選細胞。目前，用于腫瘤過繼免疫治療的γδT細胞主要是通過體外擴增制備[1- 2]。但是，中晚期腫瘤患者或化療后患者體內免疫抑制，導致γδT細胞數量減少和免疫活性下降，致使體外擴增γδT細胞數量受限，難以得到治療所需量的細胞制劑。利用基因修飾的方法獲得足夠數量的腫瘤反應性γδ T細胞，用于腫瘤的γδT細胞特異性過繼治療，不失為獲取數量充足、安全且有良好生物學功能的γδT細胞制劑的可取途徑?；赗NA基因修飾淋巴細胞的過繼細胞免疫治療的研究已有報道[3- 4]。本研究擬以加強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因為對象，建立體外轉錄及電轉mRNA至抗CD3抗體擴增的外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中的方法，以為新型基因工程γδTCR表達細胞制備提供新的技術支持。

1 材料與方法

1.1 質粒與菌種

pGEM4Z/EGFP/A64是含EGFP基因序列的表達重組質粒，用于體外轉錄mRNA(布魯塞爾自由大學Joeri L.Aerts教授惠贈)；大腸桿菌DH5α為本室保存，基因型為：supE44lacU169(80lacZM15)hsdR17recA1end1gyr96thi-1relA1, 用于質粒的擴增與轉化。

1.2 試劑及試劑盒

Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶和T4DNA連接酶(Fermentas公司)；Oligo(dT)15Primer、RNA酶抑制劑、dNTP、瓊脂糖和小量質粒提取試劑盒(Promega公司)；DNA分子質量標準DL2000(大連寶生物工程有限公司)；SpeⅠ限制性內切酶(NEB公司)；胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉、氨芐青霉素等均為國產優級純或分析純試劑；細胞裂解液(Pierce公司)；淋巴細胞分離液(TBD公司)；RPMI-1640、DMEM高糖培養基(Gibco公司)；抗CD3 抗體(UCHT1)(BD公司)；DNA片段純化試劑盒(Axygen公司)；The mMESSAGE mMACHINE High Yield Capped RNA Transcription Kit(Ambion公司)；MinElute Reaction Cleanup 回收試劑盒和RNasey Mini Kit試劑盒(Qiagen公司)。

1.3 pGEM4Z/EGFP/A64質粒的轉化

取制備好的感受態細胞100 μL大腸桿菌E.coliDH5，加入1 μL質粒，混勻，冰上放置30 min，42 ℃熱休克90 s，迅速插入冰中，冰浴5 min。加入200 μL LB培養基，37 ℃ 180 r/min，振蕩培養1 h，鋪于含有氨卞青霉素的LB固體培養基上。37 ℃培養過夜至菌落直徑為1～2 mm。

1.4 質粒的小量制備

按照Qiagen質粒小量制備試劑盒說明書進行。1.5 mL單菌落培養菌液，10 000×g離心20 s，棄上清。加5 μL RNase A和250 μL冰預冷的重懸液重懸細菌沉淀，劇烈振蕩；加入250 μL新配制的裂解液，顛倒混勻，冰浴5 min，再加入350 μL冰預冷的中和液，混勻后冰上放置10 min。室溫12 000×g，離心10 min，收集上清到回收柱中， 12 000×g，離心1 min，棄廢液。加入700 μL洗脫液洗2遍。收集洗脫液，室溫干燥后，溶解于30 μL去離子水中，用于進一步實驗或-20 ℃保存備用。

1.5 線性化的pGEM4Z/EGFP/A64質粒制備

在0.5 mL離心管中加入質粒DNA 2 μg、酶切緩沖液5 μL、100×牛血清白蛋白(BSA)0.5 μL、SpeⅠ內切酶1 μL，補加去離子水至50 μL，混勻后37 ℃孵育3 h，用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切產物，DL2000作為分子質量標準。

按照MinElute Reaction Cleanup 回收試劑盒說明書操作回收線性化pGEM4Z/EGFP/A64質粒。酶切產物加入300 μL溶液ERC，混勻，加于放入2 mL收集管中回收柱上，13 000×g離心1 min，棄離出液；加750 μL洗滌液PE，13 000×g離心1 min，棄離出液；將回收柱移入新的接收管上，加10 μL EB溶液，13 000×g離心1 min，收集含DNA片段的洗脫，于-20 ℃保存備用。

1.6 體外轉錄及純化EGFP mRNA

按照Ambion公司體外轉錄試劑盒操作說明進行。取線性化重組質粒DNA 1 μg，10×T7緩沖液2 μL, 2×NTP/CAP 10 μL, T7連接酶2 μL, 補加無RNA酶水至20 μL，將上述成分輕柔混合，簡短離心后37 ℃孵育3 h，加入1 μL DNase Ⅰ于37 ℃反應15 min。

使用QIAGEN RNeasy Mini Kit，按照試劑盒操作說明純化體外轉錄的mRNA。即：加入溶液1，以調整樣品至100 μL，然后加入350 μL緩沖液RLT，混勻，加入250 μL無水乙醇，混勻。將上述樣本轉移到一個放置在2 mL的收集管上的RNeasy Mini 柱子，12 000×g離心1 min，棄離出液；加500 μL緩沖液RPE，12 000×g離心1 min，棄離出液；加500 μL緩沖液RPE，12 000×g離心2 min；將柱子轉移到一個新的1.5 mL 離心管上，加入50 μL去離子水，室溫靜置10 min后，12 000×g離心1 min；將柱子轉移到一個新的1.5 mL 離心管上，加入上一步洗脫出來的洗脫液(約45 μL)，室溫靜置10 min后，12 000×g離心1 min。收集洗脫液。測定260 nm的吸光度值(A260)，按照公式A260×稀釋倍數×40(μg/mL)計算RNA的量。分裝，-80 ℃保存備用。

1.7 抗CD3單克隆抗體擴增PBMC

RPMI-1640培養液1∶1稀釋的10%肝素抗凝正常人靜脈血，按常規法，用淋巴細胞分離液離心分離。吸取分離液界面乳白色單個核細胞層，RPMI-1640培養液洗滌3次，用含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養液調整細胞濃度至2×106個/mL，備用。

500 μL內含1 μg抗CD3單克隆抗體的RPMI-1640包被24孔板，37 ℃孵育2 h。用RPMI-1640培養液洗3次, 將重懸好的PBMC加到洗滌好的24孔培養板中，1 mL/孔，加入IL-2，終濃度為200 U/mL。37 ℃ 5% CO2環境培養，約3 d后備電轉用。

1.8 EGFP mRNA的轉染

離心收集細胞，用OPTI-MEM洗細胞1次。細胞重懸于OPTI-MEM至終濃度2.5×107/mL。冰上放置5 min。將RNA 10 μg和200 μL細胞移入電轉杯中并置入電轉儀，電轉參數為500 V 500 μs、400 V 500 μs、300 V 500 μs。電轉完畢后，立即移入含RPMI-1640完全培養基的6孔板中繼續培養。

1.9 轉染細胞的鑒定

在不同的時間收集轉染的細胞，倒置熒光顯微鏡和流式細胞儀觀察和鑒定轉染細胞EGFP的表達；臺盼藍染色計算不同電轉條件下轉染細胞的存活率。

2 結果

2.1pGEM4Z/EGFP/A64質粒的線性化及酶切鑒定

將獲得的pGEM4Z/EGFP/A64質粒經過SpeⅠ內切酶酶切，獲得了線性化的質粒。電泳鑒定結果如圖1所示，第2泳道是環形質粒，第3泳道是單酶切后的線性質粒。

1,4.DNA markers of DL15000 and DL 2000, respectively; 2.circled plasmids; 3.plasmids linearized by Spe Ⅰ圖1 線性化pGEM4Z/EGFP/A64的鑒定Fig 1 Identification of linearized plasmid pGEM4Z/ EGFP/64A

2.2 體外轉錄EGFP mRNA

20 μL反應體系，用1 μg線性化的質粒DNA轉錄并經RNeasy Mini 柱2次純化后，得到EGFPmRNA的量在12～20 μg之間；為此進行了4個反應，共獲得60 μgEGFPmRNA。

2.3 抗CD3抗體擴增人PBMC的鑒定

人PBMC經固相化抗CD3抗體擴增后，流式細胞儀檢測，80%～87%為CD3+細胞(圖2)。

圖2 抗CD3抗體擴增人PBMC的流式細胞術檢測Fig 2 Flow cytometry analysis of PBMC amplified by anti-CD3 antibody

2.4 不同條件mRNA電轉染細胞效率的鑒定

在500 V 500 μs電轉參數下轉染EGFPmRNA的細胞EGFP表達水平明顯高于在400 V 500 μs或300 V 500 μs電轉參數下轉染EGFPmRNA細胞EGFP表達量。而且在電轉48 h后的表達水平最高(圖3A)。在500 V 500 μs電轉參數下電轉染EGFP

mRNA 48 h后，表達EGFP的細胞比例達到77%(圖3B)，明顯高于在300 V 500 μs或400V 500 μs電轉參數下電轉染EGFPmRNA 表達EGFP的細胞比例。

在所采用的各種電轉條件下，倒置相差顯微鏡下計數細胞存活率均在75%以上。雖然在細胞電轉24 h時間點，500 V 500 μs電轉參數下細胞的存活率較其他參數電轉后的細胞存活率略低，但是在細胞電轉48 h后，500 V 500 μs參數電轉條件下細胞存活率可以達到85%以上，3種電轉條件之間沒有明顯的差異(圖4)。

3 討論

γδT細胞因其識別抗原廣泛，且識別沒有主要組織性復合物(major histocompatibility complex，MHC)限制性，已成為腫瘤過繼免疫治療的候選細胞。目前，將γδT細胞用于臨床不外乎以下兩種策略[2,5]：一種是體內應用γδT細胞的刺激配體，使其在體內擴增或激活γδT細胞；另一種是分離γδT細胞，隨后在體外大規模擴增，擴增后的γδT細胞用于腫瘤患者的過繼免疫治療。但是，中晚期腫瘤患者或化療后患者體內免疫抑制，導致患者可提供的細胞數量減少和免疫活性下降，致使體外擴增γδT細胞數量受限，難以得到治療所需量的細胞制劑。建立一種新的細胞制備技術勢在必行。

圖4 不同電轉條件下電轉細胞的存活率Fig 4 Comparison of the survival rates of PBMCs after EGFP mRNA electroporation under different conditions

mRNA電轉技術[6]是一種非病毒非DNA的基因轉移的方法，相對于質粒轉染具有如下優勢：首先，電轉的mRNA不同于DNA轉染，它只在宿主細胞的胞質中表達，能夠用于許多質粒轉染難以表達的細胞如原代的T細胞進行基因修飾； 再者，穩定的mRNA不含病毒啟動子，不需要對細胞具有毒性的轉染試劑，不必清除細菌污染物，電轉的信使RNA較為安全；此外，mRNA電轉后，細胞具有較高的存活率。本實驗結果很好地證明了這一優勢。但是，mRNA的電轉條件與質粒電轉條件相反，在低電壓的寬波下才能成功。最終成功獲得了mRNA電轉的優化條件，電轉EGFPmRNA入原代PBMC，獲得了77%的高表達率，以及80%以上的細胞存活率。值得注意的是，獲得足夠量的RNA是本技術的前提，因此，如何在體外獲得足夠量的成熟mRNA至關重要。采用體外轉錄完整mRNA的體系，不失為一值得選擇的方法。

總之，建立的體外轉錄及電轉mRNA至抗CD3抗體刺激的PBMC的優化條件，可成功地重塑細胞，表達轉入的外源基因。該技術為未來制備表達腫瘤反應性CDR3移植γδTCR的新型基因工程細胞制備提供新的技術支持。

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Establishment of an electroporation method fortransfection of mRNA into anti-CD3 antibody stimulated human PBMC

HU Yu1, ZHAO Hui1,2, WANG Zhun1, HE Wei1*

(1.Dept of Immunology, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS amp; School of Basic Medicine, PUMC；State Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Beijing 100005; 2.National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050，China)

ObjectiveTo establish an electroporation method to transfect mRNA into human PBMCs for the preparation of CDR3-grafted γδ T lymphocytes.MethodsLinearized plasmids pGEM4Z/EGFP/A64 containing EGFP cDNA fragment by the digestion with restriction endonucleaseSpeⅠ were used as templates forEGFPmRNA transcription.EGFPmRNA was transfected into anti-CD3 antibody-stimulated human PBMC by electroporation instrument under different conditions with 500 V and 500 μs, 400 V and 500 μs or 300 V and 500 μs, respectively. The levels of EGFP expression in the cells electroporated withEGFPmRNA were evaluated through inverted fluorescence microscope and flow cytometry. The survival rates of transfected-cells were measured by trypan blue staining.

ResultsAgarose electrophoresis showed that pGEM4Z/EGFP/A64 plasmids were well linearized bySpeⅠ digestion andEGFPmRNAs were successfully transcribedinvitro. 48 hours after mRNA-transfection, EGFP expression in cells transfectedEGFPmRNAs under the condition of 500 V and 500 μs attained 77% which were significantly higher than those in cells transfectedEGFPmRNAs under other conditions. The survival rate of transfected cells under the condition of 500 V and 500 μs reached up to 85%.ConclusionsThe electroporation platform of mRNA transfection into human PBMC with parameters of 500 V and 500 μs is successfully established and may be useful to prepare genetically modified T lymphocytes by mRNA transfection.

mRNA; electroporation; PBMC; EGFP

2014- 03- 19

2014- 04- 11

國家高技術研究發展計劃(863計劃)(2012AA020901)

*通信作者(correspondingauthor)：mianyi333@163.com

1001-6325(2014)06-0782-05

R 392.12

A