不同菌劑處理對玉米芯發酵過程中纖維素降解及相關酶活性的影響

鮮開梅

（新疆維吾爾自治區農技農業技術推廣總站，烏魯木齊，830049）

育苗基質是能為幼苗提供穩定協調的水、氣、肥、結構的生長介質，是無土育苗的重要組成部分。大量被拋棄或燃燒的廢棄物經過一定加工處理后可作為良好的環保型無土栽培有機基質。近年來，科研工作者利用各種農業副產有機物及某些廢棄物研制合成了成本低、資源豐富、可再生的環保型無土栽培有機基質，在各園藝作物上栽培應用效果良好。

目前有機廢棄物的有效利用主要通進行高溫好氧堆肥化處理，使堆肥原料中的不穩定有機物形成性質穩定、對農作物無害的堆肥產品。但堆肥速度與質量依基質種類、發酵條件（發酵微生物、基質C/N比、含水、氧量等）而不同，其中微生物菌劑與菌種的選擇是關系堆肥速度與質量的重要因素。

傳統秸稈堆肥通常都是采用改善環境條件或增加營養的方法，往往存在發酵時間長、有臭味且肥效低等問題[1，2]，而且作物秸稈中含有大量成分復雜、難以被充分利用或被大多數微生物直接作為碳源物質而轉化利用的木質纖維素[3]。在發酵過程中，降解由易到難依次為：粗脂肪和碳水化合物＞纖維素和半纖維素＞木質素。如何提高它們的分解速率、縮短發酵周期、提高降解率、得到穩定的發酵產物是目前研究的難點；木質纖維素的生物降解成為生物技術處理作物秸稈的關鍵，也是近年的研究重點。

目前研究表明[4～6]，采用接種微生物菌劑或有效菌種處理秸稈堆肥，明顯地促進了堆肥反應進程。陳華癸[7]教授曾指出，在堆肥過程中，進行人為接種分解有機物能力強的微生物，可加速堆肥材料的腐熟，且形成利于消滅某些病原體、蟲卵和雜草種子的高溫。秸稈堆肥發酵過程中，目前有采用單一菌株作為發酵劑的方法，也有采用高效復合菌劑作為發酵劑。此外，在堆肥發酵過程中加入木質素分解菌以促進木質素這類難降解有機物質的分解，可有效縮短發酵時間，提高堆肥處理效果。

玉米芯是玉米的副產品，新疆地區玉米資源豐富，每年經過脫粒下的玉米芯，倘若經過腐熟堆肥化作用后作為無土栽培基質，對資源的綜合利用和地方經濟的發展有很大的促進作用。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2013年3月5日至12月10日在石河子大學農學院試驗站設施溫室內進行。以玉米芯為材料。試驗采用的3種市售微生物菌劑分別是：EM酵素菌（購于河南磐龍酵素菌生物工程有限公司）；有機物料腐熟劑（購于北京世紀阿姆斯生物技術有限公司）；金寶貝菌劑（購于北京華夏康源科技有限公司）。

1.2 試驗方法與處理

試驗采用堆肥化腐熟處理，堆置前將玉米芯粉碎至0.3～0.5 cm，玉米芯添加羊糞、尿素以及水等配料，調配至適宜的C/N比（30∶1）及控制總物料含水量為50%～60%，將預培養的菌劑均勻地與玉米芯基質充分混合。試驗共設置4個處理，詳見表1，以不添加發酵菌劑的處理為對照（CK）。隨機區組設計，重復3次。堆體體積約直徑1.5 m，高0.8 m，堆體上覆蓋塑料薄膜進行發酵。堆肥發酵期間每天14：00觀察堆體溫度，待堆體溫度達到65℃左右時，及時翻堆并調整水分含量在50%～60%。在試驗期間共取樣 4 次，依次為發酵后 0，10，20，30 d，取各處理堆體中心部位處基質100 g作為樣品，帶回實驗室使其自行風干后進行理化性質的測定。待堆體溫度與環境溫度基本一致、發酵物料變成深褐色、無惡臭味時結束。

1.3 測定內容及方法

①纖維素、半纖維素、木質素含量的測定 發酵結束后取發酵樣品烘干至恒重，參考賀明娟等[8]的方法分析其中纖維素、半纖維素、木質素的含量，結合初始發酵物料中各纖維類組分的含量，分別計算纖維素、半纖維素和木質素的降解率。

②酶液提取 隔5 d取2.0 g發酵的固體基質，用12 mL雙蒸水于4°C浸提甘草渣固體培養物過夜，200 r/min振蕩提取1 h，轉移提取液；再用4 mL雙蒸水，于200 r/min振蕩提取15 min，重復一次，完全轉移、合并提取液，4°C保存待測酶活性。

③酶活性測定 a.木質素過氧化物酶（LiP）活力測定。取0.2 mL藜蘆醇溶液（10 mmol/L）、0.4 mL酒石酸緩沖液（250 mmol/L，pH值3.0）與0.4 mL粗酶液混勻，即得1 mL反應液。在30℃下，往此反應液中加20 μL H2O2溶液 （20 mmol/L） 啟動酶促反應，并在310 nm波長下測定反應1 min前后的反應液吸光度變化。一個酶活力單位（U）定義為每1 min氧化藜蘆醇產生1 μmol藜蘆醛所需的酶量。

b.漆酶（Lac）活力的測定。采用ABTS法，反應液在30℃保溫3 min，后在波長420 nm處測定吸光值的增加。將在100℃煮沸15 min的酶液作為陰性對照。酶活力單位定義為反應體系中每1 min引起0.1個吸光度增加所需的酶量。

c.纖維素酶（FP）活力的測定。取0.5 mL的酶液，加入1 mL 1%CMC-Na溶液，混勻，50℃水浴15 min，加入2 mL DNS煮沸 10 min，流水冷卻，加蒸餾水定容至10 mL，混勻，測OD540值。對照：在0.5 mL稀釋酶液加入1 mL 1%CMC-Na溶液，再加入2 mL DNS煮沸10 min，流水冷卻，加蒸餾水定容至10 mL，混勻，測OD540值。酶活力定義為每1 min產生1 μmol的葡萄糖的酶量為一個酶活力單位。

d.羥甲基纖維素酶（CMC）、木聚糖酶活性測定。采用DNS法。

表1 不同發酵菌劑的試驗處理

1.4 數據處理

數據取平均值，采用 Excel 2003和DPS 7.5軟件進行處理，并進行Duncan's多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同菌種處理下玉米芯基質發酵過程中纖維素、半纖維素降解率的變化

①纖維素降解率 由圖1可知，經過30 d的發酵培養，3種不同菌種處理下的玉米芯基質發酵過程中的纖維素均有不同程度降解。在發酵10 d測得，T1、T2和T3的纖維素降解率為12.3%、15.8%和 15.4%，分別比對照的 12.1%高 1.7%、30.6%和25.6%，T2和T3與對照相比差異顯著。在發酵20 d測得，T1、T2和T3的纖維素降解率為26.6%、25.7%和23.7%，分別比對照的18.6%高43.0%、38.2%和 37.6%，T1、T2和T3與對照相比差異顯著，T1和T2之間無顯著差異。在發酵30 d測得，T1、T2和 T3的纖維素降解率為 44.4%、34.4%和36.3%，分別比對照的24.9%高78.30%、38.2%和45.8%，T1、T2和T3與對照相比差異顯著，T2和T3之間無顯著差異。說明3種菌種處理可有效地提高玉米芯基質的纖維素降解率，T1效果最佳。

②半纖維素降解率 從圖2可看出，半纖維素隨發酵時間的延長降解趨勢與纖維素一致。經過30 d的發酵培養，3種不同菌種處理下的玉米芯基質發酵過程中的半纖維素均有不同程度的降解。在發酵10 d測得，T1、T2和T3的半纖維素降解率為24.3%、20.0%和 23.1%，分別比對照的13.8%高76.1%、44.9%和 67.4%，T1、T2和 T3與對照相比差異顯著，T1和T3間無顯著差異，但與T2差異顯著。在發酵20 d測得，T1、T2和T3的半纖維素降解率為35.3%、28.5%和34.5%，分別比對照的23.3%高51.5%、22.3%和48.1%，T1、T2和T3與對照相比差異顯著，T1和T3之間無顯著差異，但與T2差異顯著。在發酵30 d測得，T1、T2和T3的半纖維素降解率為48.9%、43.9%和42.1%，分別比對照的35.8%高36.6%、22.6%和17.6%，T1、T2和T3與對照相比差異顯著，T2和T3之間無顯著差異，但與T1達到顯著差異。說明3種菌種處理均可有效提高玉米芯基質的半纖維素降解率，其中T1效果最佳。

2.2 不同菌種處理下玉米芯基質發酵過程中木質素降解率的變化

由圖3可知，3種不同菌種處理下的玉米芯基質發酵過程中的木質素均有不同程度的降解。在發酵 10 d測得，T1、T2和 T3的木質素降解率為12.2%、12.4%和15.9%，分別比對照的11.1%高9.9%、10.9%和43.2%，T1和T2與對照相比無顯著差異，T3與對照之間差異顯著。在發酵20 d測得，T1、T2和 T3的木質素降解率為 16.0%、18.3%和25.1%，分別比對照的 15.2%高 5.3%、20.4%和65.1%，T1與對照相比無明顯差異，T1、T2和T3之間差異顯著。在發酵30 d測得，T1、T2和T3的木質素降解率為25.1%、24.6%和29.5%，分別比對照的19.6%高 28.1%、25.5%和 50.5%，T1、T2和 T3與對照相比差異顯著，T1、T2和T3之間差異顯著。說明3種菌種處理均可有效提高玉米芯基質的木質素降解率，其中T3效果最佳，T1次之。

2.3 不同菌種處理下玉米芯基質發酵過程中纖維素降解酶活性的變化

①纖維素酶 從圖4可以看出，纖維素酶活性表現先升高后降低的趨勢，在0～10 d的時間，隨著發酵天數的增加，纖維素酶活性逐漸增強，在發酵10 d后測得3種添加菌劑的玉米芯基質中的纖維素酶活性均高于對照，T1活性最強，與對照相比提高36.1%，與其他各處理之間差異明顯，且T1的纖維素酶活性在發酵10 d時表現為峰值，為7.2 U/L，其他各處理均在20 d時出現峰值，之后隨著發酵時間的延長，纖維素酶活性開始緩慢降低，發酵30 d測得各處理之間無明顯差異。

②羥甲基纖維素酶 從圖5可以看出，羥甲基纖維素酶活性表現先升高后降低的趨勢，在0～10 d，隨著發酵天數的增加，羥甲基纖維素酶活性逐漸增強，在發酵10 d后測得3種添加菌劑的玉米芯基質中的羥甲基纖維素酶活性均高于對照，T1活性最強，與對照相比提高26.3%，與其他各處理之間差異明顯。T1和T2的羥甲基纖維素酶活性在發酵10 d時表現為峰值，分別為227.7 U/L和179.6 U/L。T3和CK處理均在20 d時出現峰值，之后隨著發酵時間的延長，羥甲基纖維素酶活性開始迅速降低，發酵30 d測得各處理的羥甲基纖維素酶活性表現為最低，各處理之間無明顯差異。

圖1 纖維素降解率的變化

圖2 半纖維素降解率的變化

圖3 木質素降解率的變化

圖4 纖維素酶活性的變化

2.4 不同菌種處理下玉米芯基質發酵過程中木質素降解酶活性的變化

①木質素過氧化物酶 從圖6可以看出，在0～30 d，除對照的木質素過氧化物酶活性變化不明顯外，各發酵處理木質素過氧化物酶活性表現先升高后降低的趨勢。在0～10 d，隨著發酵天數的增加，各處理木質素過氧化物酶活性逐漸增強，在發酵10 d后測得3種添加菌劑的玉米芯基質中的木質素過氧化物酶活性均高于對照，T1、T2和T3分別較對照提高125.4%、50.1%和175.1%。T3活性最強，在發酵20 d后達到峰值，與對照相比提高362.5%，且與其他各處理間差異明顯，之后迅速下降，在發酵30 d后測得的木質素過氧化物酶活性仍高于其他各處理，且差異明顯，T1和T2與對照之間無明顯差異。

②漆酶 如圖7所示，在整個試驗過程中對照和各處理漆酶活性表現先升高后降低的趨勢，在0～20 d，隨著發酵天數的增加，漆酶活性逐漸增強，在0～10 d增加迅速，之后T3的漆酶活性仍保持較高速度的增長，在發酵20 d時CK、T1和T3的漆酶活性均達到最大值，測得3種添加菌劑的玉米芯基質中的漆酶活性均高于對照，T3活性明顯高于CK、T1和T2。之后隨著發酵時間的延長，漆酶活性開始急劇降低，發酵30 d測得T3處理漆酶活性高于其他各處理，但各處理之間無明顯差異。

2.5 不同菌種處理下玉米芯基質發酵過程中木聚糖酶活性的變化

從圖8中可以看出，木聚糖酶活性表現先升高后降低的趨勢，在0～20 d，隨著發酵天數的增加，木聚糖酶活性逐漸增強，在發酵20 d后急劇下降，在試驗過程中，測得3種添加菌劑的玉米芯基質中的木聚糖酶活性與對照差異均不明顯。且各處理的木聚糖酶活性在發酵20 d時表現為峰值，之后隨著發酵時間的延長，木聚糖酶活性開始急劇下降，發酵30 d測得T1的木聚糖酶活性表現為最低。

3 結論與討論

本試驗研究結果表明，不同發酵菌劑處理下，玉米芯中半纖維素的降解率普遍高于纖維素的降解率，說明所用菌種（劑）對半纖維素都具有較強的降解能力，玉米芯中半纖維素比較容易降解。

本研究結果表明，經過30 d的發酵培養，3種不同菌種處理下的玉米芯基質發酵過程中的纖維素均有不同程度的降解，說明3種菌種處理可有效的提高玉米芯基質的纖維素降解率，其中T1效果最佳。同時，3種菌種處理也均可有效地提高玉米芯基質的木質素降解率，其中T3效果最佳，T1次之。研究結果表明，通過利用木質素優良降解菌和纖維素優良降解菌混合發酵降解木質素、纖維素和半纖維素的降解工藝是可行的，有一定的實用性。這種共降解工藝為甘草渣的生物降解提供了一種新途徑。同時利用市場上現售菌劑對玉米芯進行降解，也具有一定的實用性，加快了玉米芯發酵進程，縮短了發酵時間。

圖5 羥甲基纖維素酶活性的變化

圖6 木質素過氧化物酶活性的變化

圖7 漆酶活性的變化

圖8 木聚糖酶活性的變化

真菌分解木質素主要是依靠一個復雜的胞外過氧化酶系統。該系統主要由木質素過氧化物酶（Lignin Peroxidase/LiP）、錳過氧化物酶（Manganases Peroxidase/MnP）和漆酶（Laccase/Lac）3 種酶構成。白腐菌是少數的能選擇性降解木質素的真菌之一，它們通過分泌木質素降解酶系的主要成分等胞外氧化酶來降解木質素。在3種不同處理下的發酵過程中分別取樣進行木質素過氧化物酶、漆酶的測定，結果表明，在0～30 d的發酵時間內，除對照的木質素過氧化物酶活性變化不明顯外，各發酵處理木質素過氧化物酶活性表現為先升高后降低的趨勢；在發酵10 d后測得3種添加菌劑的玉米芯基質中的木質素過氧化物酶活性均高于對照；在整個測定過程中對照和各處理漆酶活性表現先升高后降低的趨勢，發酵30 d測得T3處理漆酶活性高于其他各處理，但各處理之間無顯著差異。以上結果說明，在玉米芯發酵過程中，金寶貝微生物菌劑能促進基質中木質素過氧化物酶活性和漆酶活性的增強，促進基質腐熟，使有機物料釋放大量的養分。

木聚糖是植物細胞的一種主要的結構多糖，是自然界含量位居第2位的多糖，占地球上約1/3的可再生有機碳源，是半纖維素的主要成分，木聚糖酶是一類水解酶，可以將木聚糖降解成低聚木糖和木糖。本研究結果表明，在0～30 d的發酵過程中，木聚糖酶活性表現先升高后降低的趨勢，在0～20 d，隨著發酵天數的增加，木聚糖酶活性逐漸增強，在發酵20 d后急劇下降，測得3種添加菌劑的玉米芯基質中的木聚糖酶活性與對照無明顯差異。

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