蛋白酶體抑制劑MG132減輕糖尿病大鼠腎小管間質(zhì)纖維化

王圓圓，劉麗榮，李 霜，郭 兵，石 磊，石明雋，肖 瑛

在糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)發(fā)生發(fā)展過程中，轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)激活其下游的 Smad2/3，導(dǎo)致其目的基因的轉(zhuǎn)錄活化，促進腎小管上皮細胞(renal tubular epithelial cells，RTECs)向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)及細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的合成和過度沉積，造成廣泛的腎組織纖維化［1－5］。Smad7 作為抑制性Smad蛋白，可抑制 TGF-β1/Smads信號通路致纖維化效應(yīng)［1，6］。然而在 DN 進程中，Smad7蛋白的表達是顯著下調(diào)的，其機制可能與Smad泛素化調(diào)節(jié)因子2(Smad ubiquitin regulatory factor 2，Smurf2)介導(dǎo)的泛素化降解有關(guān)［1，7］。蛋白酶體抑制劑 MG132能對抗糖尿病介導(dǎo)的腎損傷［8－10］，但其抑制腎小管-間質(zhì)纖維化的機制尚不甚清楚。本研究旨在觀察DM大鼠腎組織Smurf2、Smad7蛋白及纖維化相關(guān)指標(biāo)的表達變化，并用MG132處理RTECs后高糖培養(yǎng)，觀察對 Smad7和 Smurf2及EMT和ECM相關(guān)指標(biāo)的影響，探討MG132治療腎小管-間質(zhì)纖維化的機制，為MG132治療DN提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

鏈脲菌素(streptozotocin，STZ)和MG132(Sigma公司);胎牛血清(Gibco Introvagen公司)、低糖DMEM培養(yǎng)液(Hyclone公司);Rabbit-anti-SMAd7、Rabbit-anti-角 蛋 白 18(Cytokeratin-18，CK-18)、Mouse-anti-α-平滑肌肌動蛋白(α-sooth muscle actin，α-SMA)、Rabbit-anti-纖 連 蛋 白 (fibronectin，F(xiàn)N)和 Rabbit-anti-膠 原 蛋 白 Ⅰ(CollagenⅠ，Col-Ⅰ)多克隆抗體(博奧森生物技術(shù)有限公司)，Mouse-anti-β-actin單克隆抗體和DAB顯色劑(博士德生物技術(shù)有限公司)，Rabbit-anti-Smurf2(1∶600)(Abcam 公司)、Rabbit-anti-鈣黏蛋白(E-cadherin)(Santa Cruz公司);兩步法免疫組化檢測試劑(中杉金橋生物技術(shù)有限公司);Western印跡用PVDF膜;Goat-anti-Rabbit FITC、Goat-anti-Mouse Tex-red、4，6-二氨基-2-苯基吲哚(4，6-diamino-2-phenyl indole，DAPI);超敏 ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天生物研究所);其他試劑均為市售分析純;RERCs(NRK-52E細胞)由上海復(fù)旦大學(xué)陸利民教授惠贈。

1.2 方法

實驗動物及糖尿病模型的制備:清潔級雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量(180±20)g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，批號:SCXK(京)2009-0004。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，乙醚麻醉后尾靜脈按55 mg/kg注射0.01 mol/L無菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.5)的鏈脲菌素。48 h后測空腹血糖，血糖值≥16.7 mmol/L為糖尿病組(DM)。并設(shè)同齡正常對照組(NC)，每組(n=10)。各組大鼠均給予普通飼料，自由飲水。實驗24周時處死動物，處死前收集24 h尿液，記錄尿量。禁食6～8 h，稱重，麻醉后股動脈采集血液，4℃離心，分離血清，尿液和血清于－20℃保存供檢測尿蛋白及生化指標(biāo)用。開腹取胰腺和腎臟，胰腺及一側(cè)腎臟固定于4%多聚甲醛，供制作石蠟切片用，另一腎臟于－80℃保存供Western blot印跡檢測。

1.3 生化指標(biāo)檢測和組織形態(tài)學(xué)觀察

采用氧化酶法測血清葡萄糖(BG);考馬斯亮藍法測尿蛋白(UP)，Bayer1650全自動生化分析儀檢測。尿蛋白與尿量乘積為24 h尿蛋白量。胰腺及腎臟組織行石蠟切片，HE染色后光鏡下觀察胰腺形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，HE、Masson染色觀察腎組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)改變和纖維化病變。

1.4 細胞培養(yǎng)

將細胞分為1)正常糖對照組(NG):予以0.12‰的溶媒二甲基亞砜(DMSO)加入DMEM+2%胎牛血清培養(yǎng)3 h后，換DMEM+2%胎牛血清培養(yǎng);2)高糖對照組(HG):予以 0.12‰ DMSO加入DMEM+2%胎牛血清培養(yǎng)3h后，換19.5 mmol/L D-glucose+DMEM+2%胎牛血清培養(yǎng);3)高糖MG132處理組:予于終濃度分別為1μmol/L MG132，2 μmol/L MG132，5 μmol/L MG132 加入DMEM+2%胎牛血清培養(yǎng)3h后，換19.5 mmol/L D-glucose+DMEM+2%胎牛血清培養(yǎng);每組繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.5 免疫組化染色、免疫熒光染色和Western blot檢測

用免疫組化兩步法檢測組織切片Smad7(1∶200)、Smurf2(1∶600)、E-cadherin(1∶100)、α-SMA(1∶100)、FN(1∶50)及 Col-Ⅰ(1∶150)在各組大鼠腎組織的分布和表達。FN、Col-Ⅰ陽性表達計數(shù)方法參考本實驗室以前的研究［1］，計數(shù)10個高倍視野(400倍)，取均值。用免疫熒光間接染色法分別檢測CK-18(1∶100)、FN(1∶100)、E-cadherin(1∶200)、α-SMA(1∶100)在 NRK-52 細胞表達和分布，OLYMPUS-DP72倒置熒光顯微鏡觀察并采集圖像。

各組大鼠腎皮質(zhì)及細胞加裂解液裂解，分別提取蛋白，經(jīng)電泳轉(zhuǎn)膜封閉后，特異性抗體孵育濃度如下:Smad7(1∶200)、Smurf2(1∶600)、E-cadherin(1∶200)、α-SMA(1∶150)、Col-Ⅰ(1∶200)和β-actin(1∶400)，檢測各目標(biāo)蛋白的相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，兩組間比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，S-N-K法檢驗。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況和生化指標(biāo)的變化

DM大鼠逐漸出現(xiàn)多飲、多尿、多食等現(xiàn)象，體質(zhì)量顯著減輕(p＜0.05);而24 h尿蛋白(313.06±47.7 vs 39.22±10.31)mg及血糖(28.34±4.60)vs(7.13±1.26)mmol/L顯著高于NC組(p＜0.05)。

2.2 糖尿病大鼠胰腺組織和腎組織病理學(xué)改變

NC組大鼠胰島完整，輪廓規(guī)則整齊，胰島內(nèi)細胞排列整齊，胞質(zhì)飽滿，細胞界限清楚，DM組胰島內(nèi)形態(tài)欠規(guī)則，細胞排列紊亂，常有細胞缺失、塌陷及炎性細胞浸潤(圖1A)。

NC組腎臟結(jié)構(gòu)清晰完整，腎小管上皮細胞飽滿，DM組大鼠部分腎小管擴張，腎臟結(jié)構(gòu)排列不清，可見腎小體和腎小管的纖維化明顯，腎小管上皮細胞空泡變性，細胞萎縮和脫落，小管間質(zhì)細胞增多伴有炎性細胞的浸潤，間質(zhì)區(qū)增寬，毛細血管基底膜增厚(圖1B)。

2.3 糖尿病大鼠腎組織 E-cadherin、α-SMA及FN、Col-Ⅰ分布和表達

E-cadherin在大鼠腎組織主要表達于腎小管上皮細胞，在正常大鼠的腎皮質(zhì)表達較高，而DM大鼠表達減少;相反，α-SMA正常大鼠的腎皮質(zhì)表達極少，而在DM組大鼠腎小管上皮細胞可見到大量陽性染色。與NC組相比，DM組大鼠腎皮質(zhì)中E-cadherin蛋白的表達明顯下調(diào)(p＜0.05)，α-SMA蛋白的表達顯著增多(p＜0.05)(圖2)。

NC組大鼠腎組織 FN及Col-Ⅰ的陽性染色僅少量存在于細胞間質(zhì);DM組大鼠腎組織FN和Col-Ⅰ的表達明顯增加(p＜0.05)，腎小管間質(zhì)尤為明顯(圖3)。

圖1 各組大鼠胰腺和腎組織形態(tài)學(xué)變化Fig 1 Histological change of pancreas and kidneys in each group rats(×200)

2.4 Smad7及Smurf2蛋白在各組大鼠腎組織中的表達

Smad7及Smurf2在大鼠腎組織主要分布于腎小管上皮細胞，與NC組相比，DM組大鼠腎皮質(zhì)中Smad7蛋白的表達明顯下調(diào)(p＜0.05)，而Smurf2在DM組大鼠腎組織表達顯著增加(p＜0.05)(圖4)。

2.5 NRK-52E細胞鑒定

NRK-52E細胞高表達E-cadherin和CK-18蛋白，幾乎看不到α-SMA蛋白陽性染色表達，說明培養(yǎng)細胞純度良好(圖5)。

圖4 Smad7及Smurf2蛋白在各組大鼠腎組織中的表達Fig 4 Expressions of Smad7 and Smurf2 in kidney tissue in each group，n=10)

圖5 E-cadherin、α-SMA及CK-18在NRK-52E細胞的表達Fig 5 Immunofluorescencel staining of E-cadherin，α-SMA and CK-18 in NRK-52E cells(×200)

2.6 不同環(huán)境下NRK-52E細胞E-cadherin、α-SMA及FN的表達

NRK-52E細胞在正常糖環(huán)境培養(yǎng)下，E-cadherin表達較多，而α-SMA表達極少;相反，在高糖環(huán)境培養(yǎng)48 h后，E-cadherin表達明顯減少，而α-SMA表達增多(圖6A)。高糖培養(yǎng)NRK-52E細胞后，F(xiàn)N蛋白明顯增多，主要沉積于細胞間質(zhì)(圖6B)。

2.7 MG132對高糖培養(yǎng)NRK-52E細胞E-cadherin，α-SMA及Col-Ⅰ表達的影響

高糖顯著上調(diào) NRK-52E細胞中 α-SMA和Col-Ⅰ蛋白表達(p＜0.05)，下調(diào) E-cadherin蛋白表達(p＜0.05);隨MG132濃度的增高，高糖環(huán)境下NRK-52E細胞α-SMA和Col-Ⅰ蛋白表達減少(p＜0.05)，而E-cadherin蛋白表達增多(p＜0.05)(圖7)。

2.8 MG132對 NRK-52E細胞 Smad7、Smurf2蛋白表達的影響

高糖環(huán)境下NRK-52E細胞中Smad7蛋白表達減少，而Smurf2蛋白的表達增多;MG132預(yù)處理濃度的增高，Smad7蛋白表達較單一高糖處理組逐漸增多(p＜0.05)，但Smurf2蛋白的表達與單一高糖處理組相比無明顯差異(圖8)。

圖6 不同環(huán)境下E-cadherin、α-SMA及FN在NRK-52E細胞的表達Fig 6 Immunofluorescencel staining of E-cadherin，α-SMA，F(xiàn)N in NRK-52E cells after incubated in the different conditions(×200)

圖7 MG132對高糖培養(yǎng)NRK-52E細胞E-cadherin，α-SMA及Col-Ⅰ表達的影響Fig 7 Effects of MG132 on the expressions of E-cadherin，α-SMA and Col-Ⅰ in NRK-52E cells after incubated in the different conditions(，n=3)

圖8 MG132對NRK-52E細胞Smad7及Smurf2蛋白表達的影響Fig 8 Effects of MG132 on the protein expressions of Smad7 and Smurf2 in NRK-52E cells after incubated in the different conditions( s，n=3)

3 討論

DM大鼠24周時，尿蛋白持續(xù)高濃度，腎組織纖維化病變嚴(yán)重，E-cadherin顯著減少，而α-SMA高表達，提示RTECs EMT的發(fā)生，且FN及Col-Ⅰ在腎間質(zhì)也顯著增加，表明ECM的沉積增多。體外高糖培養(yǎng)NRK-52E細胞 48 h后，E-cadherin顯著減少，而α-SMA高表達;FN和Col-Ⅰ表達也明顯增多。故在高糖的持續(xù)刺激下，RTECs發(fā)生EMT且大量合成和分泌ECM，導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)和功能的紊亂。

研究表明，TGF-β1/Smads通路在腎小管-間質(zhì)纖維化發(fā)揮著多種致纖維化效應(yīng):參與RTECsEMT過程、促進間質(zhì) ECM 合成、介導(dǎo) RTECs 的損傷［1－3，6］。而Smad7蛋白可與TβRI形成一個穩(wěn)定復(fù)合物，并抑制其招募和磷酸化R-SMAd以及R-SMAd-SMAd4復(fù)合物的形成［11］，從而負(fù)調(diào)控TGF-β1/Smads 通路的傳導(dǎo)。有報道在腎纖維化病程時，活化TGF-β1/Smads通路可誘導(dǎo)Smad7基因的表達［7］，但Smad7蛋白的表達卻是減少的，這可能是由于TGF-β1介導(dǎo)E3泛素連接酶Smurf2特異性的識別Smad7將其泛素化后被蛋白酶體降解所致［1，7］。本研究提示:較正常對照組，在DM大鼠腎組織Smurf2高表達而Smad7蛋白表達下調(diào)，與體外高糖處理RTECs結(jié)果一致。有作者在UUO模型、5/6腎切除大鼠模型發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果［2－3］。因此DN時Smurf2表達增加，促進了Smad7的泛素化途徑的降解，導(dǎo)致TGF-β1/Smads信號通路失去控制，纖維化效應(yīng)級聯(lián)放大。相反，上調(diào)或過表達Smad7基因的DM大鼠可以減輕糖尿病導(dǎo)致的腎纖維化［1，6］。所以，恢復(fù)內(nèi)源性Smad7蛋白表達成為防治DN的研究重點。

蛋白酶體抑制劑MG132能對抗糖尿病引起多種機制介導(dǎo)的腎損傷［9］。MG132屬于醛基肽類化合物，該類化合物通過結(jié)構(gòu)中的醛基和蛋白酶復(fù)合體催化中心20S的β1和β2蘇氨酸殘基的-OH結(jié)合，可逆性的抑制蛋白酶復(fù)合體的活性，進而抑制蛋白的降解［12］。本研究予于MG132干預(yù)NRK-52E細胞后高糖培養(yǎng)，致Smad7表達上調(diào)，EMT過程和ECM沉積受到抑制，而且這種效應(yīng)呈現(xiàn)出量效依賴性，但Smurf2蛋白表達并未發(fā)生改變。提示MG132上調(diào)Smad7蛋白表達不是通過減少起識別作用的Smurf2表達，而是抑制蛋白酶體對靶蛋白的降解作用所致。從而可恢復(fù)Smad7蛋白表達，抑制EMT的發(fā)生和ECM的合成，減輕了腎小管-間質(zhì)纖維化的發(fā)展，這可能是MG132治療DN的機制之一。

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