阿托伐他汀下調(diào)大鼠心肌梗死后線(xiàn)粒體融合素2表達(dá)和細(xì)胞凋亡

周 煒，陳 玲，周 逸，陳曼華

心肌細(xì)胞凋亡是引起心肌梗死后心功能不全、心室重塑及心律失常的重要原因［1］。目前發(fā)現(xiàn)，他汀類(lèi)藥物可通過(guò)原癌基因Ras法尼基化的相關(guān)機(jī)制誘導(dǎo)磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositide 3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號(hào)通路激活，發(fā)揮其調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡、心肌保護(hù)等調(diào)脂外作用［2－3］。線(xiàn)粒體融合素 2(mitofusin 2，Mfn2)是利用差異顯示法從自發(fā)性高血壓大鼠體內(nèi)克隆獲得的基因，其表達(dá)產(chǎn)物可負(fù)向調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［4］。目前關(guān)于他汀類(lèi)藥物對(duì)Mfn2的調(diào)節(jié)作用尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)建立大鼠急性心肌梗死模型，觀察阿托伐他汀對(duì)心肌細(xì)胞凋亡及Mfn2表達(dá)的影響，進(jìn)一步闡明其抗心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

凋亡檢測(cè)(TUNEL)試劑盒(Roche公司);Mfn2抗體(Abcam 公司)，p-Akt抗體、Akt抗體、α-肌動(dòng)蛋白(α-actin)抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(Cell signaling公司)。免疫組化試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液(武漢博士德公司);阿托伐他汀(阿斯利康制藥有限公司)。其他的試劑采用國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

SPF級(jí)雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量(250±30)g(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，動(dòng)物許可證號(hào):【SYXK(鄂)2009-0049】。實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組(sham);心肌梗死組(myocardial infarction，MI);阿托伐他汀1組(statin 1);阿托伐他汀2組(statin 2)，共4組，每組12只。Statin 1組和statin2組術(shù)前7 d開(kāi)始每日灌胃，給予阿托伐他汀10和40 mg/kg，劑量的選擇參考文獻(xiàn)［5］。Sham組及MI組予等量蒸餾水灌胃。

1.3 建立大鼠心肌梗死模型

參照文獻(xiàn)［1］進(jìn)行。腹腔注射3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠，小動(dòng)物呼吸機(jī)鼻面罩輔助通氣。開(kāi)胸后分離胸膜、心包，在左心耳下緣、肺動(dòng)脈圓錐水平結(jié)扎左前降支。造模成功的標(biāo)準(zhǔn)為:1)心電圖標(biāo)準(zhǔn)II導(dǎo)聯(lián)ST段呈弓背向上型抬高，2)結(jié)扎動(dòng)脈遠(yuǎn)端心肌出現(xiàn)蒼白。假手術(shù)組開(kāi)胸后于左前降支下穿線(xiàn)，不結(jié)扎。各組存活至術(shù)后24 h的動(dòng)物數(shù)量分別為sham 組(12只)，MI組(9只)，statin 1組(10只)，statin 2組(10只)。處死大鼠后取心臟標(biāo)本，4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水，石蠟包埋后切片。

1.4 TUNEL染色檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡

按試劑盒操作說(shuō)明染色，以細(xì)胞質(zhì)染成棕黃色為陽(yáng)性，每張切片在梗死邊緣區(qū)域(假手術(shù)組在左室前壁)隨機(jī)取5個(gè)高倍鏡視野，記錄陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)，AI(%)=凋亡細(xì)胞質(zhì)數(shù)/總細(xì)胞質(zhì)數(shù)×100%，每張切片取5個(gè)視野求均值。

1.5 免疫組化法檢測(cè)Mfn2蛋白表達(dá)

按試劑盒說(shuō)明操作檢測(cè)Mfn2蛋白表達(dá)。每張切片在梗死邊緣區(qū)域(假手術(shù)組在左室前壁)隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野，虛擬顯微鏡拍攝圖像，使用Image pro-Plus圖像分析軟件測(cè)定Mfn2蛋白表達(dá)平均吸光度值(mean absorbance)。

1.6 免疫印跡法檢測(cè)p-Akt的表達(dá)

提取組織總蛋白，測(cè)定蛋白濃度。蛋白上樣量為50μg，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，將膜在一抗(抗β-actin、抗p-Akt、抗Akt)中4℃孵育過(guò)夜。緩沖液洗脫后放入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗中室溫孵育2 h后進(jìn)行檢測(cè)。Quantity One軟件測(cè)定條帶吸光度值，進(jìn)行半定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組心肌細(xì)胞凋亡的分布

凋亡細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色，正常細(xì)胞質(zhì)呈藍(lán)色。Sham組心肌細(xì)胞未見(jiàn)明顯凋亡;與MI組比較，阿托伐他汀1組、2組AI均顯著下降(p＜0.05)，且阿托伐他汀2組較1組AI降低更顯著(p＜0.05)(圖1，表1)。

2.2 各組心肌組織Mfn2蛋白的表達(dá)

Sham組未見(jiàn)明顯心肌梗死區(qū)域，Mfn2蛋白少量表達(dá);與sham組比較，MI組在心肌梗死邊緣區(qū)域Mfn2蛋白表達(dá)顯著增加(p＜0.01);與MI組比較，阿托伐他汀1組和2組Mfn2表達(dá)顯著降低(p＜0.05)，且阿托伐他汀2組較1組表達(dá)更低(p＜0.05)(圖2，表1)。

圖1 各組TUNEL染色結(jié)果Fig 1 Comparison of TUNEL staining results among 4 groups(×400)

表1 各組凋亡指數(shù)、p-Akt以及Mfn2吸光度值的比較Table 1 Comparison of the apoptosis index，the mean absorbance of p-Akt and Mfn2 among 4 groups，%，n=6)

表1 各組凋亡指數(shù)、p-Akt以及Mfn2吸光度值的比較Table 1 Comparison of the apoptosis index，the mean absorbance of p-Akt and Mfn2 among 4 groups，%，n=6)

*P ＜0.01 compared with sham;△P ＜0.05 compared with MI;#P ＜0.05 compared with statin 1．

group apoptosis index mean absorbance of Mfn2 mean absorbance of p-Akt sham 0.00±0.00 8.14±1.34 82.34±5.12 MI 61.32±6.37* 49.52±3.29* 9.57±0.19*statin 1 37.24±3.56＊△ 33.61±2.07＊△ 17.25±1.42＊△statin 2 24.49±3.14＊△# 24.18±1.93＊△# 25.31±2.55＊△#

圖2 各組免疫組化染色結(jié)果Fig 2 Comparison of immunohistochemical staining results among 4 groups(×200)

2.3 各組心肌組織p-Akt的表達(dá)

與sham組比較，MI組心肌組織中p-Akt蛋白表達(dá)顯著降低(p＜0.01);與MI組比較，阿托伐他汀1和2組p-Akt表達(dá)顯著上升(p＜0.05)，且阿托伐他汀2組較1組表達(dá)更高(p＜0.05)(圖3;表 1)。

3 討論

心肌細(xì)胞凋亡是急性心肌梗死早期細(xì)胞丟失的重要形式，Ras-PI3K/Akt信號(hào)通路是促發(fā)心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵路徑［6］。通過(guò)藥物或基因治療干預(yù)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制細(xì)胞凋亡，有可能成為防治心肌梗死的有效手段［7］。

圖3 各組免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果Fig 3 Comparison of Western blot results among 4 groups

他汀類(lèi)藥物是廣泛應(yīng)用于臨床的調(diào)脂藥物，具有多重調(diào)脂以外的作用。研究發(fā)現(xiàn)，他汀類(lèi)藥物通過(guò)抑制甲羥戊酸合成，使其下游的焦磷酸法尼酯和焦磷酸牛兒基牛兒酯減少，阻礙小三磷酸鳥(niǎo)苷結(jié)合蛋白R(shí)as、Rho、Rac等異戊二烯化，影響 Ras-PI3K/Akt及絲裂原活化的蛋白激酶信號(hào)通路，具有抗氧化應(yīng)激及抗炎等調(diào)脂外作用［2－3，8］。本研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)前7天開(kāi)始每日給予阿托伐他汀可顯著抑制大鼠急性心肌梗死后的細(xì)胞凋亡，且具有一定的劑量依賴(lài)性。

Mfn2是一種線(xiàn)粒體外膜蛋白，對(duì)線(xiàn)粒體形態(tài)及功能有重要的調(diào)節(jié)作用［4］。Mfn2也是細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中一個(gè)新的調(diào)控點(diǎn)。該基因是原癌基因Ras的直接負(fù)調(diào)控因子，能夠與其相互作用，阻滯Ras-PI3K/Akt信號(hào)通路，抑制 Akt磷酸化，進(jìn)而減少BCL-2蛋白表達(dá)，增加Bax蛋白表達(dá)，通過(guò)線(xiàn)粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠發(fā)生急性心肌梗死后，局部組織Mfn2表達(dá)顯著增高，p-Akt表達(dá)顯著降低，表明Akt磷酸化受到抑制，提示缺血缺氧損傷激活了Mfn2的表達(dá)，從而促發(fā)心肌細(xì)胞凋亡增加。而阿托伐他汀干預(yù)則可顯著下調(diào)Mfn2表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)Akt磷酸化，抑制心肌細(xì)胞凋亡，作用呈一定的劑量依賴(lài)性。

初步結(jié)果顯示，Mfn2基因可能是大鼠心肌梗死過(guò)程中一個(gè)重要的促凋亡基因，參與阿托伐他汀抑制心肌梗死后細(xì)胞凋亡的過(guò)程，也是阿托伐他汀發(fā)揮其心肌保護(hù)作用的一個(gè)重要靶基因，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

［1］Bhushan S，Kondo K，Predmore BL，et al．Selective β2-adrenoreceptor stimulation attenuates myocardial cell death and preserves cardiac function after ischemia-reperfusion injury［J］．Arterioscler Thromb Vasc Biol，2012，32:1865 －1874．

［2］Tanaka S，F(xiàn)ukumoto Y，Nochioka K，et al．Statins exert the pleiotropic effects through small GTP-binding protein dissociation stimulator upregulation with a resultant Rac1 degradation［J］．Arterioscler Thromb Vasc Biol，2013，33:1591－1600．

［3］Song XJ，Yang CY，Liu B，et al．Atorvastatin inhibits myocardial cell apoptosis in a rat model with post-myocardial infarction heart failure by downregulating ERstress response［J］．Int JMed Sci，2011，8:564 －572．

［4］Zhou W，Chen KH，Guo XM，et al．Mutation of the protein kinase A phosphorylation site influences the anti-proliferative activity of mitofusin 2［J］．Atherosclerosis，2010，211:216－223．

［5］Preusch MR，Vanakaris A，Bea F，et al．Rosuvastatin reduces neointima formation in a rat model of balloon injury［J］．Eur JMed Res，2010，15:461 －467．

［6］Ishihara Y，Shimamoto N．Sulfaphenazole attenuates myocardial cell apoptosis accompanied with cardiac ischemiareperfusion by suppressing the expression of BimEL and Noxa［J］．J Pharmacol Sci，2012，119:251 － 259．

［7］高建芝，王永玲，李東亮，等．姜黃素預(yù)處理減輕急性心肌缺血大鼠心肌細(xì)胞凋亡［J］．基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2011，31:1247－1250．

［8］黃茶花，謝遙，黃曉，等．阿托伐他汀減輕缺血復(fù)合冷應(yīng)激誘導(dǎo)的大鼠心肌損傷［J］．基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2011，31:1200－1204．

［9］Guo XM，Chen KH，Guo YH，et al．Mitofusin 2 triggers vascular smooth muscle cell apoptosis via mitochondrial death pathway ［J］． Circulation Res， 2007，101:1113－1122．