清化飲對慢性胃炎脾胃濕熱證胃黏膜蛋白的影響

付肖巖，陳小玲，王 薇，胡光宏，徐從榮，林 平，高尤亮

（福建中醫藥大學附屬第二人民醫院，福建 福州350003）

慢性胃炎為臨床常見病、多發病，病程長，往往纏綿不愈，嚴重影響患者的生活質量。脾胃濕熱證是慢性胃炎常見的實證，有研究顯示399例慢性胃炎中，屬脾胃濕熱證 209 例（占 52.38%）［1］。目前研究顯示中醫藥對其治療效果顯著高于西藥［2-4］。清化飲是我國名老中醫楊春波主任醫師治療慢性胃炎脾胃濕熱證的經驗方，具有良好的臨床療效［5］，但清化飲治療慢性胃炎脾胃濕熱證的作用機制目前尚未闡明。本實驗應用雙向凝膠電泳技術研究清化飲對慢性胃炎脾胃濕熱證患者胃黏膜蛋白的影響，以期為清化飲治療慢性胃炎脾胃濕熱證作用機制提供進一步的理論依據。

1 臨床資料

1.1 病例選擇條件

1.1.1 西醫診斷標準 參照2012年中華醫學會消化病學分會制定的《中國慢性胃炎共識意見》［6］。胃鏡診斷標準：慢性非萎縮性胃炎胃鏡下可見黏膜紅斑，黏膜出血點或斑塊，黏膜粗糙伴或不伴水腫，及充血滲出等基本表現。慢性萎縮性胃炎胃鏡下可見黏膜紅白相間，以白相為主，皺襞變平甚至消失，部分黏膜血管顯露，可伴有黏膜顆粒或結節狀等表現。

病理診斷標準：① 慢性炎癥 正常：單個核細胞每高倍視野不超過5個，如數量略超過正常而內鏡下無明顯異常，病理可診斷為基本正常；輕度：慢性炎癥細胞較少并局限于黏膜淺層，不超過黏膜層的1／3；中度：慢性炎癥細胞較密集，不超過黏膜層2／3；重度：慢性炎癥細胞密集，占據黏膜全層。②活動性0：慢性炎癥背景上無中性粒細胞浸潤；+：黏膜固有層有少數中性粒細胞浸潤；++：中性粒細胞較多存在于黏膜層，可見于表面上皮細胞、小凹上皮細胞或腺管上皮內；+++：中性粒細胞較密集，或除中度所見外還可見小凹膿腫。③ 萎縮 輕度：固有腺體減少不超過原有腺體的1／3來計算；中度：固有腺體數減少介于原有腺體的1／3～2／3；重度：固有腺體數減少超過2／3，僅殘留少數腺體，甚至完全消失。④ 腸化輕度：腸化區占腺體和表面上皮總面積1／3以下；中度：腸化區占腺體和表面上皮總面積1／3～2／3；重度：腸化區占腺體和表面上皮總面積2／3以上。

1.1.2 脾胃濕熱證辨證標準 參照2011年中國中西醫結合學會消化系統疾病專業委員會制定的《慢性胃炎的中西醫結合診療共識意見》［7］，主癥：① 胃脘痞脹或疼痛；②舌質紅，苔黃膩或黃厚。次癥：①胃脘灼熱；② 口臭口苦；③ 惡心嘔吐；④ 大便黏滯；⑤脈滑數或濡數。判斷：具備主癥2項加次癥1項，或主癥第1項加次癥2項即可診斷。

1.1.3 納入標準

1.1.3.1 健康對照組 ①年齡大于18歲且小于60歲的健康體檢者；②經本院體檢中心檢查排除主要臟器的器質性疾病及糖尿病等內分泌疾病者；③鏡下黏膜正常，且無上消化道不適癥狀；④ 同一部位（胃竇部）的3塊活檢標本病理提示為正常和／或輕度淺表性炎癥者。

1.1.3.2 治療組 ① 年齡大于18歲且小于60歲的患者；② 符合西醫慢性胃炎診斷標準者；③ 符合中醫脾胃濕熱證辨證標準者。

1.1.4 排除標準 ①18歲以下或60歲以上患者，妊娠或哺乳期婦女；② 合并心血管、腦血管、肝腎和造血系統等嚴重原發性疾病，精神病患者；③ 實驗前2周服用過抑酸藥物、糖皮質激素、非甾體類抗炎藥和抗生素者。

1.2 一般資料 30例患者均來源于我院2013年2月—2013年12月消化內科門診及病房。其中男15例，女 15例；年齡 30～57歲，平均年齡（38±8.26）歲；病程1個月～8 a。同時按照簡單隨機抽取方法選取我院2013年2月—2013年12月健康體檢者30例作為健康對照組。其中男17例，女13例；年齡28～59 歲，平均年齡（40±7.15）歲。

2 材料與方法

2.1 材料 清化飲由綿茵陳、薏苡仁、厚樸、生扁豆、黃連、赤芍、白豆蔻、佩蘭等組成（我院院內制劑，500 mL／瓶，生產批號：130210）；固相 pH 梯度干膠條（24 cm，pH 3～10）、兩性電解質（pH 3～10）、蛋白質濃度測定試劑盒均購自北京中原合聚經貿有限公司；等電聚焦儀PROTEAN IEF Cell、電泳儀 Power／PAC 3000、PROTEAN DodecaCell 垂 直 電 泳 儀 、GS710掃描儀 （Bio-Rad）、PDQuest 8.0軟件均購自biorad公司。

2.2 治療方法 治療組服用清化飲，每次20 mL，每日3次，餐前半小時口服，療程共1個月。

2.3 標本采集及保存 健康對照組、治療組胃黏膜組織標本均在我院胃鏡室收集，每個標本取5塊（胃竇2塊取自距幽門2～3 cm處的大彎和小彎；胃體2塊取自距賁門8 cm處的大彎和小彎；胃角1塊，約距胃角近側4 cm）。活檢樣本用生理鹽水反復沖洗以去除血液等污染后，在30 min內保存于標記好的凍存管中-80℃冰箱保存。

2.4 胃黏膜總蛋白的提取 ① 用液氮預冷的砸碎器將組織砸碎，再用液氮將砸碎的粉末研磨，加入Cocktail蛋白酶抑制劑。②將一部分lysis加入樣品粉末中，將其溶解，再轉入Dounce勻漿器中，上下勻漿10次。③將樣品放入燒杯里超聲，超聲杯必須裝有冰水混合物，按照21%振幅進行超聲。④在冰上提取，時間為 30 min。 ⑤ 離心（14000 g×1 h），棄沉淀取上清。

2.5 雙向凝膠電泳 用雙向凝膠電泳（2-DE）方法進行蛋白質分離，利用考馬斯亮藍染色方法［8］進行電泳凝膠染色。

2.6 凝膠圖像采集及分析 銀染后的雙向凝膠應用GS710掃描儀進行掃描，圖像分析使用PDquest 8.0軟件。分析包括蛋白質斑點的檢測、量化、背景去除和點的匹配。

3 治療結果

3.1 療效判斷標準 參照2011年中國中西醫結合學會消化系統疾病專業委員會制定的《慢性胃炎的中西醫結合診療共識意見》［7］。胃鏡及病理療效判定標準：①治愈：胃鏡復查活動性炎癥消失，慢性炎癥好轉達輕度，腺體萎縮、腸化生和異型增生消失；②顯效：黏膜急性炎癥基本消失，慢性炎癥好轉，腺體萎縮、腸化生和異型增生明顯減輕；③ 有效：黏膜病變范圍縮小1／2以上，炎癥有所減輕，腺體萎縮、腸化生和異型增生減輕；④ 無效：內鏡及病理所見均無好轉者。中醫證候療效判定標準：①臨床痊愈：主要癥狀、體征消失或基本消失，療效指數≥95%；②顯效：主要癥狀、體征明顯改善，70%≤療效指數＜95%；③ 有效：主要癥狀、體征明顯好轉，30%≤療效指數＜70%；④ 無效：主要癥狀、體征無明顯改善，甚或加重，療效指數＜30%。

療效指數＝［（治療前積分－治療后積分）／治療前積分］×100%。

所有癥狀均分為無、輕、中、重4級，主癥分別記以 0、2、4、6 分，次癥分別記以 0、1、2、3 分。

3.2 治療組療效 ① 中醫證候療效：治愈率為3.33%，顯效率為33.33%，有效率為60%，總有效率96.67%。② 胃鏡下療效：治愈率為10%，顯效率為30%，有效率為53.33%，總有效率93.33%。③ 病理療效：治愈率為0%，顯效率為26.67%，有效率為53.33%，總有效率80%。

3.3 實驗結果 在相同條件下分別對各組胃黏膜總蛋白進行雙向凝膠電泳分離，考馬斯亮藍染色后獲得各組的2-DE圖譜，見圖1。再經GS710掃描儀掃描后，經PDQuest8.0圖像分析軟件分析，每塊雙向凝膠可分離近600個左右蛋白質點。3次雙向凝膠電泳圖譜有極大相似形，在相同的設定值下獲得了健康對照組、治療組治療前、治療后胃黏膜蛋白質點數依次為（510±22）個、（527±49）個、（526±30）個。經圖像分析統計后發現：治療組與健康對照組比較有21個蛋白表達上調，10個蛋白表達下調；治療組治療前后比較，表達上調21個蛋白質中有18個表達降低，而表達下調10個蛋白質中有9個表達增強。各差異蛋白質點見表1。

4 討 論

清化飲作為治療慢性胃炎脾胃濕熱證的一個代表方，具有良好的臨床療效，然而目前對于清化飲的研究只停留在藥效觀察水平，國內外均未見清化飲對慢性胃炎脾胃濕熱證患者胃黏膜蛋白影響的文獻報道。差異蛋白質組學是針對動態變化著的蛋白質組的整體來進行比較，分析不同蛋白質組表達上的差異，可以發現與疾病相關的特異蛋白質，而這些特異蛋白質不僅可作為疾病診斷及治療的標志物，還可為疾病的致病機制提供線索［9-10］。故本實驗應用蛋白質組學方法，研究清化飲對慢性胃炎脾胃濕熱證胃黏膜蛋白的影響。

圖1 3組胃黏膜2-DE圖譜

表13組有明顯差異的蛋白質點

清化飲方中綿茵陳性苦微寒，以其善能清熱利濕，又因其長于三月獨得春升之氣，故入肝經兼能上行，為君藥；薏苡仁利水滲濕而健脾；生扁豆味甘性微溫，能醒脾化濕；白豆蔻化濕行氣，溫中止嘔；佩蘭能化濕解暑；輔以苦寒之黃連清熱燥濕；配以辛溫之厚樸化濕理氣除滿；佐以赤芍以清熱涼血，散瘀止痛。全方藥性平和，藥味精，藥量輕，寒溫并用，共奏清熱化濕、理氣活血之功。本研究從中醫證候療效、胃鏡下療效、病理療效等多方面觀察，結果發現清化飲能有效減輕臨床癥狀，改善慢性胃炎脾胃濕熱證患者胃鏡下及病理表現。因此，清化飲治療慢性胃炎脾胃濕熱證有良好的臨床療效。

蛋白質組學研究之所以能迅速發展，要歸功于雙向凝膠電泳技術的創立和不斷完善，它是分離組織細胞蛋白質組分的核心技術［11］。所以，建立圖像清晰、分辨率高和重復性好的2-DE圖譜是蛋白質組學研究的關鍵。因此，本實驗對胃黏膜標本的采集、總蛋白的提取、2-DE的上樣量進行了多次的摸索，在樣品、雙向凝膠的制備及考馬斯亮藍染色等過程中盡量保持其統一性，獲得了圖像清晰、分辨率高和重復性好的胃黏膜蛋白的2-DE圖譜。經圖像分析統計后發現：慢性胃炎脾胃濕熱證患者與正常人比較有21個蛋白表達上調，10個蛋白表達下調，表明胃黏膜蛋白質表達異常可以作為慢性胃炎脾胃濕熱證的臨床診斷標志物之一；慢性胃炎脾胃濕熱證清化飲治療前后比較，表達上調21個蛋白質中有18個表達降低，而表達下調10個蛋白質中有9個表達增強，表明清化飲治療慢性胃炎脾胃濕熱證可能是通過調節胃黏膜蛋白的表達而實現。具體是什么蛋白質起作用，有待進一步進行質譜分析。

中醫證候具有整體性、動態性和異病同證、同病異證等特征，建立能反映證候本質并能區別他證的定性、定量、定位綜合實驗指標具有重要的臨床意義［12］。從蛋白質水平探討中醫辨證論證的實質，將進一步提高中醫對疾病規律的認識和治療水平，有助于疾病的早期診斷和治療。

［1］楊春波，黃可成，肖麗春，等.脾胃濕熱證的臨床研究400例資料分析［J］.中醫雜志，1994，35（7）：425.

［2］郎振翼.不換金正氣散加減治療慢性胃炎脾胃濕熱證療效觀察［J］.中國醫藥導報，2011，8（25）：91-92.

［3］李明強.半夏瀉心湯加減治療慢性胃炎脾胃濕熱證55例［J］.中國中醫藥現代遠程教育，2008，6（5）：474.

［4］于鶴軒.蒿芩清膽湯加味治療慢性胃炎脾胃濕熱證臨床觀察［J］.遼寧中醫藥大學學報，2007，9（1）：97-98.

［5］黃恒青，張海鷗，楊永升，等.清化飲治療慢性胃炎脾胃濕熱證療效觀察［J］.福建中醫藥，2004，35（3）：9-10.

［6］房靜遠，劉文忠，李兆申，等.中國慢性胃炎共識意見（2012年）［J］.中華消化雜志，2013，33（1）：5-16.

［7］中國中西醫結合學會消化系統疾病專業委員會.慢性胃炎中西醫結合診療共識意見（2011年）［J］.中國中西醫結合雜志，2012，32（6）：738-743.

［8］LI C，ZHAN X，LI F，et al.Proteomic comparison of two-dimensional gel electrophresis profiles from human lung squamous carcinoma and normal bronchial epithelial tissues［J］.Genomics Proteomics Bioinformatics，2003，1（1）：58-67.

［9］WILKINS M R，SANCHEZ J C，GOOLEY A A，et al.Progress with proteome projects：why all proteins expressed by a genome should be identified and how to do it［J］.Biotechnol Genet Eng Rev，1996（13）：19－50.

［10］ESPEJEL F，ROA J C.Surface enhanced laser desorption ／ionization（SELDI）：proteomics technology and its application in oncology［J］.Med Clin，2008，131（8）：312-317.

［11］ZHOU M，YU L R.Proteomic analysis by tw o-dimensional polyacrylam ide gel electrophoresis［J］.Adv Protein Chem，2003，65（4）：57-84.

［12］余宗陽，杜建.蛋白質組學與中醫證候實質研究［J］.中國中西醫結合雜志，2004，24（9）：844-846.