松散型花椰菜小孢子植株再生研究

2014-12-09 22:41:17單曉政文正華劉莉莉姚星偉江漢民

天津農業科學 2014年6期

單曉政+文正華+劉莉莉+姚星偉+江漢民+吳峰+牛國保+孫德嶺

摘要：以松散型花椰菜子葉型小孢子胚為外植體，研究冷處理、活性炭及AgNO3對小孢子植株再生的影響。結果表明：對小孢子胚進行3 d的4 ℃冷處理培養，能提高其胚芽誘導率和胚芽數；培養基中添加1.0 g·L-1的活性炭對提高小孢子胚芽誘導率沒有明顯效果，但能有效減輕胚芽的玻璃化；添加5.0～7.0 mg·L-1的AgNO3對小孢子胚芽誘導有顯著效果。

關鍵詞：松散型花椰菜；小孢子胚；植株再生

中圖分類號：S635.3 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.06.001

相對于緊實型花椰菜，松散型花椰菜花球松散、梗青球白、生脆可口、味道鮮美，近年來逐漸贏得我國消費者的喜愛，種植面積不斷擴大。利用游離小孢子技術獲得松散型花椰菜小孢子植株或DH群體已有報道[1]，雖然松散型花椰菜小孢子培養的產胚率相對較高，但小孢子胚在分化和繼代培養中，仍然存在褐化、玻璃化、愈傷化、停止生長和畸形生長等現象，直接影響小孢子植株的再生率。已有報道稱基因型、胚齡、瓊脂濃度、培養基添加物等都是影響小孢子植株再生的重要因素[2-3]，而適當的冷處理、干燥處理、子葉切除等能提高小孢子胚的植株再生能力。

本文探討了冷處理、活性炭和AgNO3對松散型花椰菜小孢子植株再生的影響，旨在進一步完善游離小孢子培養體系，并為該技術在蔬菜育種中的應用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

‘津松65、‘津松70等8個松散型花椰菜品種由天津科潤蔬菜研究所花椰菜課題組提供。

1.2 方法

將供試材料進行游離小孢子培養，培養方法參考顧宏輝[1]的方法，將獲得的子葉型小孢子胚狀體置于光照下，轉綠后，即可用于小孢子胚芽誘導試驗。將變綠后的子葉型胚轉入基本培養基（MS+6-BA0.2 mg·L-1+蔗糖30.0 g·L-1+瓊脂13.5 g·L-1）中進行培養，其中以高出胚率品種‘津松65和‘津松70的小孢子胚為試材，研究冷處理、活性炭和AgNO3對小孢子胚芽誘導的影響。3種處理設置條件為：將剛轉入固體培養基的胚置于光照培養箱中4 ℃冷處理3 d，以冷處理0 d為對照；在基本培養基中添加1.0 g·L-1活性炭，以不添加活性炭為對照；在基本培養基中分別添加1.0，3.0，5.0，7.0，9.0 mg·L-1的AgNO3，以不添加AgNO3為對照。每個處理接種小孢子胚24個，3次重復，25 d后統計胚芽誘導率和胚芽數。胚芽誘導率=出芽胚狀體數/接種胚狀體數×100%。

2 結果與分析

2.1 冷處理對小孢子胚芽再生的影響

對2個供試材料的小孢子胚進行3 d的冷處理后，胚芽誘導率和出芽數均有顯著提高（表1）。經冷處理后，‘津松65的胚芽誘導率由52.0%提高到了83.0%，平均出芽數也由2.37 個·胚-1增加到2.89個·胚-1，‘津松70的胚芽誘導率由61.8.0%提高到88.3%，而平均出芽數由0.68個·胚-1提高到了1.83個·胚-1。

2.2 活性炭對小孢子胚芽再生的影響

活性炭處理后，2個供試材料的小孢子胚芽誘導率和出胚數與對照相比差異不顯著（表2）。

但在添加活性炭的培養基中生長的胚芽出現玻璃化的概率減小，并且長成的幼苗比較健壯，成活率較高，而未添加活性炭的培養基中的胚芽玻璃化現象較嚴重。

2.3 AgNO3在小孢子胚芽再生中的作用

從表3可以看出，在培養基中分別添加5.0～7.0 mg·L-1的AgNO3，小孢子胚芽分化率和胚平均出芽數與不添加AgNO3相比均差異顯著。‘津松65在添加7.0 mg·L-1的AgNO3時，胚芽誘導率提高到83.7%，添加了5.0 mg·L-1的AgNO3后，平均出芽數達到2.85個·胚-1，‘津松70在添加5.0 mg·L-1的AgNO3后，胚芽誘導率提高到98.2%，而平均出芽數由0.76個·胚-1提高到了2.26個·胚-1。這表明在培養基中附加5.0～7.0 mg·L-1的AgNO3可顯著提高松散型花椰菜小孢子胚芽誘導率和每個胚狀體分化芽的數量。

2.4 再生苗的繼代、生根和移栽

將獲得的胚芽切下接種到繼代培養基中，之后每20～30 d繼代1次，可以使芽苗長得健壯。經繼代3～4次的芽苗接種到含NAA的生根培養基中，15 d左右即可長出健壯的根系，通常經繼代的芽苗較不經繼代的芽苗生根速度快、根短粗、成活率高。將組培苗移栽到自然環境生長前要煉苗1～2 d，之后移栽于含蛭石∶草炭（1∶2）的營養缽中，并進行遮蔭保濕。

3 結論與討論

冷處理、活性炭和AgNO3在小孢子培養中的作用已有大量報道，但在小孢子植株再生中的作用研究較少。Ritala[4]對大麥小孢子胚進行4個星期的4 ℃處理，可以明顯提高生成苗的效率；周偉軍等[5]對油菜小孢子再生研究時發現，在胚狀體移入固體再生培養基后立即進行10 d的低溫誘導處理（2 ℃），常溫光下培養，可以直接、快速再生成苗，成苗率達62.5%，且再生植株的生長狀況與無低溫誘導的再生植株無明顯區別；Zhang[6]對油菜小孢子胚狀體進行3 d或5 d的冷處理，能使胚發芽率和成苗率分別提高到90.0%和58.48%。本試驗將小孢子胚在4 ℃處理3 d，發現胚芽誘導率最高可達到90%以上，說明冷處理對提高胚芽的再生確實有效。

韓陽[7]在大白菜小孢子植株再生研究中發現，培養基中添加200 mg·L-1活性炭可以大幅度提高小孢子胚成苗率，其原理可能是活性炭吸附了瓊脂中不利于細胞生長的某些物質。其他研究者也曾報道活性炭對小孢子胚狀體發生有很好的促進作用。本研究發現添加活性炭與未添加活性炭小孢子胚芽誘導無明顯差異，這可能跟活性炭濃度有關，活性炭濃度較高反而對胚芽誘導沒有明顯促進作用。但是，本試驗中發現，在添加活性炭的培養基中生長的胚芽在之后的培養中玻璃化現象明顯減輕，這說明活性炭可能在克服小孢子胚芽玻璃化方面有重要作用。

AgNO3作為一種乙烯抑制劑經常被用于植物離體培養中。許多研究指出，在植物離體培養中，AgNO3不僅能提高芽誘導率，還能有效抑制褐化。唐桂香[8]發現，培養基中添加AgNO3能顯著提高甘藍型油菜子葉的不定芽分化誘導率。趙秀樞[9]發現，AgNO3在羽衣甘藍不定芽誘導過程中起抑制作用。高紅亮[10]在不結球白菜離體再生研究中發現添加5～10 mg·L-1AgNO3可顯著提高不定芽分化率和每個外植體分化芽的數量。楊曉楓[11]發現，甘藍型油菜外植體愈傷組織誘導率和芽再生率與AgNO3密切相關。本試驗將AgNO3用于松散型花椰菜小孢子植株再生中，也發現適宜濃度的AgNO3在一定程度上提高了松散型花椰菜小孢子胚芽誘導率和再生率，但濃度過高對胚芽再生起抑制作用。

參考文獻：

[1] 顧宏輝，朱丹華，楊加付. 小孢子培養獲得松花型花椰菜DH再生植株[J]. 農業生物技術學報，2007，15（2）：301-305.

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[4] Ritala A， Mannonen L， Oksman-Caldentey K M. Factors affecting the regeneration capacity of isolation barley microspores （Hordeum vulgare L.）[J]. Plant Cell Rep， 2001，20（5）：403-407.

[5] 周偉軍，毛碧增，顧宏輝，等. 秋水仙堿及熱擊與低溫對油菜小孢子胚狀體成苗率的影響[J].作物學報， 2003， 28（3）：369-373.

[6] Zhang G Q， Zhang D Q， Tang G X. Plant development from microspore-derived embryos in oilseed rape as affected by chilling， desiccation and cotyledon excision[J]. Biologia Plantarum， 2006， 50（2）：180-186.

[7] 韓陽，葉雪凌，馮輝. 提高大白菜小孢子植株獲得率的研究[J].園藝學報， 2005， 32（6）：1 092-1 094.

[8] 唐桂香，周偉軍.AgNO3對甘藍型油菜子葉外植體再生的影響[J].中國油料作物學報，2001，23（3）：9-12.

[9] 趙秀樞，李名揚，張文玲.觀賞羽衣甘藍高頻再生體系的建立[J]. 基因組學與應用生物學，2009，28（1）：141-148.

[10] 高紅亮，李英，宋玉萍. 不結球白菜離體培養與植株再生體系研究[J]. 西北植物學報， 2008， 28（5）：963-968.

[11] 楊曉風，秦波，周偉軍. 二步培養和AgNO3對甘藍型油菜子葉和下胚軸芽再生的影響[J]. 中國油料作物學報. 2009，31（2）：137-142.