睪丸酮叢毛單胞菌3α—HSD的研究進展

吳興海+劉靖靖+王建華

摘 要： 3α-HSD（3α-hydroxysteroid dehydrogenase）是睪丸酮叢毛單胞菌在以類固醇為唯一碳源時，產生的一種類固醇脫氫酶，也是降解類固醇的關鍵酶。本文對睪丸酮叢毛單胞菌3α-HSD基因的調控、酶蛋白結構與功能等生物學特點進行闡述，總結了3α-HSD蛋白的兩種獲得途徑：天然提取和人工誘導表達途徑。從技術可行性、實用性和成本控制等幾個方面，分析比對二者的優勢和不足。介紹和展望了睪丸酮叢毛單胞菌3α-HSD在血清總膽汁酸測定、轉基因生物工程、環境或食品中類固醇類激素檢測及環境修復等領域的研究現狀和應用前景。

關鍵詞：睪丸酮叢毛單胞菌；3α-HSD；研究進展

中圖分類號：Q939.9 文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.06.014

睪丸酮叢毛單胞菌（Comamonas testosteroni）存在于人體胃、腸道、尿液及土壤、泥漿、水體中，是一種嚴格需氧、非發酵的革蘭氏陰性細菌。睪丸酮叢毛單胞菌由Talalay 等[1]首先從池塘泥漿中分離得到，當其生長在含有類固醇的培養基上或環境中存在類固醇底物誘導時，可產生多種類固醇脫氫酶和11種降解酶，其中之一是3α羥基類固醇脫氫酶（3α-hydroxysteroid dehydrogenase， 3α-HSD），一種能夠利用分解甾體類和多環芳烴類化合物作為菌體生長所需要的碳源和能源的關鍵酶。

目前認為，3α-HSD不僅是睪丸酮叢毛單胞菌在以類固醇為唯一碳源時，產生的一種醇脫氫酶，也是降解類固醇的關鍵酶，還廣泛地存在于原核和真核生物體內，是人體調節性激素代謝水平的重要酶類[2-3]。1998年研究人員發現睪丸酮叢毛單胞菌的降解酶3α-類固醇脫氫酶在降解消化甾類物質中起主導作用，并對這個基因的調控機理進行了初步研究，認識到3α-HSD是C19～C27類固醇分解代謝途徑中最初的酶之一[4]。在過去15年的時間里，睪丸酮叢毛單胞菌3α-HSD的結構和調控研究得到長足進展，其作用機制和功能的奧秘被逐步揭示，在幾個關鍵領域的應用研究已取得顯著成果。筆者擬就3α-HSD的研究進展結合自身研究項目進行簡要綜述，以期進一步系統了解睪丸酮叢毛單胞菌3α-HSD的表達調控機理，為今后拓寬其在環境修復、食品安全、醫學檢驗研究領域的應用作以鋪墊。

1 3α-HSD的生物學特點

1.1 3α-HSD基因的調控

3α-HSD基因全長774bp，編碼258個氨基酸的肽鏈，肽鏈分子量在26.4KD左右。3α-HSD的表達過程較為復雜，在轉錄水平受多個因子調控，從最初的負調控因子阻遏蛋白RepA、RepB和活化因子Activator，到近年來發現的正調控因子TeiR基因和LysR基因，都對其轉錄過程起到抑制或促進作用。

1.1.1 阻遏蛋白（RepA和RepB） 在3α-HSD基因附近有4個開放的閱讀框架（orf l、orf 2、orf 3、orf 4），與基因的誘導、表達與調控密切相關。3α-HSD基因受2個阻遏蛋白（RepA和RepB）的負調控，類固醇通過阻斷阻遏蛋白與調控區的結合，誘導3α-HSD的表達[5]。Rep A和Rep B分別由420和78個氨基酸組成，由框架orf 2 和 orf 3編碼。Rep B可與3α-HSD mRNA的5端環狀結構相結合，其編碼框orf 3的方向與3α-HSD方向相反。RepA識別位點有兩處，RepA與這2個序列結合，形成一個1.6 kb的環狀結構，阻遏了細菌RNA聚合酶與hsd A啟動子區域的結合，從而抑制3α-HSD基因的表達。國內外學者的研究表明，去除這2處DNA序列可顯著提高3α-HSD基因的表達，而類固醇等甾體類誘導劑的加入可全面抑制阻遏蛋白RepB和3α-HSD基因mRNA的結合及RepA與順式操縱子雙位點的結合，從而促進3α-HSD基因的表達和翻譯過程的順利進行。

1.1.2 正調控因子 Activator是與增強子或與活化因子結合區域結合的蛋白，是一種在啟動子上可以增加轉錄起始速度的DNA結合蛋白[6]。當活化因子與下游基因的啟動子的活化因子結合部位結合后，就能促使更多的RNA聚合酶集聚到下游基因的啟動子附近，提高下游基因的轉錄起始速度。研究表明，在C.testosteroni染色體上編碼3α-HSD基因上游的2.6 kb處存在activator基因，該基因全長為564 bp。通過研究可以發現，利用睪丸酮叢毛單胞菌的activator 能提高3α-HSD/CR轉錄速率，通過將強啟動子整合入C. testosteroni染色體中，使強啟動子位于activator基因的上游來加強該細菌activator基因的表達，最終加強下游一系列基因表達的構想是可行的[7-9]。

類固醇誘導蛋白（testosterone-inducible regulator，teiR）基因和LysR基因是近年來被研究發現的3α-HSD基因正調控因子[10]。2004年，一種用于降解類固醇新的睪丸酮叢毛單胞菌蛋白被研究人員發現，中文譯為睪丸酮誘導調節子[11]。TeiR序列在C末端保留了螺旋-轉角-螺旋 （Helix-turn -helix， HTH） 式的LuxR基因DNA結合區域。與LuxR相似蛋白相同，該蛋白與目的基因轉錄起始點上游lux盒結合后可以激活或抑制目的基因的轉錄。國內外學者的多個研究同時表明[10-11]，在培養基中加入類固醇進行誘導的情況下，在基因表達過程中teiR基因緊密地控制著轉錄水平，而一個teiR缺失的突變菌株無法以類固醇作為單一的碳源。值得注意的是，在teiR缺失的突變體中3α-HSD基因也失去了降解類固醇的功能。這可能是由于突變體中，睪丸酮無法與teiR N端自主誘導物結合區域進行結合而不能進入細胞體內，從而抑制了睪丸酮與阻遏物結合誘導關鍵酶3α-HSD表達的能力，最終導致突變體喪失了正常的降解功能。利用反向對比實驗可以發現當teiR基因插入到teiR缺失突變體菌株后，3α-HSD基因轉錄水平得以恢復。通過以上研究不難看出，teiR基因對睪丸酮叢毛單胞菌的酶解類固醇基因的轉錄過程進行正向調控，是3α-HSD等類固醇降解基因的mRNA完全表達的重要組成原件。大腸桿菌的共轉化試驗支持了這一觀點，teiR基因與帶有3α-HSD /CR基因的載體質粒后，結果發現在共轉化的大腸桿菌中3α-HSD的表達明顯高于單獨轉化的3α-HSD[11]。

2010年，繼teiR基因后，在3a-HSD / CR 基因下游3.36 kb 處又發現了大小為912 bp 的LysR 基因[12] （ 賴氨酸調節子） ，而其所屬LysR-類轉錄調節子（LTTRs）是原核生物最大的調節子家族。LTTR TsaR 蛋白無論是處于無配體形式還是復合形式都呈現為一個四元結構，與Ralstonia eutropha的CbnR，或Pseudomonas aeruginosa的LysR類調節子等明顯不同，只有LTTRs是獨特的四聚體形式。雖然3種蛋白都是頭接頭的四聚體環形，但TsaR呈現出一個開放結構，而CbnR 和 PA01-PR蛋白卻是以C末端相對連接的方式閉環。明顯的差異體現了LTTRs四聚體的自身靈活性，也是由于結構上更廣闊的通用性所導致的結果。誘導物的結合能夠帶來LTTR結構發生變化，破壞封閉結構的兩個C末端連接口。這導致TsaR-類蛋白結構被迫展開，形成雙螺旋結構，拉近彼此距離。在國內Li等[13]的研究也證明將LysR基因可明顯提高3α-HSD的表達量。

目前，這5個已發現的調控因子包括兩個阻遏蛋白RepA、RepB和3個正調控因子都能夠調節3α-HSD的表達水平，但是除阻遏蛋白和活化因子之間的作用機理較為明晰外（如圖1所示），具體到5個因子之間作用關系是縱向關聯還是橫向調控，是時間關系還是空間關系都不得而知，作用原理有待于進一步的研究。

1.2 3α-HSD酶蛋白結構與功能

1956年，Talalay等首先證實3α-HSD是類固醇代謝途徑中最初的酶之一，以后陸續從多種細菌等原核生物及動物、人體的真核細胞中發現了3α-HSD，但真核和原核3α-HSD在結構和功能等方面都存在差異較大。它們屬于不同的蛋白質超家族，真核3α-HSD屬于還原酶超家族[14]，而原核3α-HSD屬于短鏈脫氫酶（SDR）超家族[2，15-16]。作為SDR超家族的新成員，3α-HSD酶蛋白在與其他成員的蛋白結構存在一定的差異、同源性較低的同時，保留了該家族的2個特征性保守序列：N-末端的SDR超家族的氨基酸指紋Gly-X-X-X-Gly序列與155～159氨基酸殘基處的保守催化模塊Tyr-X-X-X-Lys。睪丸酮叢毛單胞菌3α-HSD不僅對環境、食品中雄酮等類固醇基質和類固醇類抗生素-梭鏈胞酸進行降解代謝，還可以催化殺蟲劑NKI 42255等非類固醇的醛及酮的氧化還原。3α-HSD酶蛋白有單體和雙體兩種形式，具體形式取決于濃度高低：濃度較高時，晶體結構為同源二聚體，對雄酮、四氫可的松、脫氧膽酸的活性大體相同，當濃度低時，二聚體解離為活性更高的單體形式，對雄酮有更高的降解活性。

2 3α-HSD蛋白的獲得途徑

從睪丸酮叢毛單胞菌中分離純化天然3α-HSD需要包含以下多個步驟：首先將培養好的細菌裂解粉碎后，離心除去細胞殘渣沉淀，然后用硫酸銨沉淀上清液，并將沉淀溶解、透析后用凝膠進行過濾層析，最后用等電聚焦電泳、親和、離子交換層析進行純化。為了避免酶活性的迅速丟失，必須在提取和純化過程中控制活性影響因子。結合酶蛋白的特點，通過分析可以發現，這種蛋白獲得途徑主要存在3個缺陷：一是步驟繁瑣，技術難度大，對操作人員的技術熟練度要求較高；二是受制于純化過程中酶活性的丟失，酶蛋白獲得率低，天然3α-HSD分離純化成本高漲，價格昂貴，生產工藝的應用及產業化受到極大限制；三是難以有效分離β-HSD與3α-HSD。

由于天然3α-HSD價格昂貴，其使用范圍受到了極大限制。鑒于這種情況，國內外的研究人員將目光放到了3α-HSD的人工誘導合成領域。隨著現代分子生物學技術和基因工程的不斷發展和成熟，以3α-HSD基因為基礎的融合蛋白高效原核表達系統的建立工作得到了充分的發展，依托于不同質粒載體的多種單價或多價表達調控體系被開發研制成功。眾多國內外學者[2，17-18]在人工誘導3α-HSD 融合蛋白領域都進行了探索，開展了大量實驗，利用不同的載體將各國不同來源睪丸酮叢毛單胞菌3α-HSD基因片段，在大腸桿菌中進行原核表達，都取得了很好效果。有些研究通過誘導表達并利用金屬螯合層析純化后可得到純度大于98%的人工蛋白，有些研究融合蛋白的酶比活性是對照菌的十余倍。

在實際過程中，筆者發現在前人研究的基礎上，摸索優化的表達條件和實驗參數，建立最優的表達調控系統對于提高人工合成融合蛋白的效率具有直接的影響。筆者所在課題組 [19]利用分子克隆的方法擴增與克隆睪丸酮叢毛單胞菌ATCC 11996的3α-HSD基因，構建表達工程菌，通過優化表達菌的最佳表達條件得到目的蛋白。通過優化純化條件，建立了3α-HSD的60%硫酸銨沉淀-親和層析-分子篩分離的高效純化方法，可以獲得具有酶活性的純度高達99%的3α-HSD，為課題的后續研究打下了堅實基礎。

3 3α-HSD的應用研究

3.1 用于血清總膽汁酸（total bile acids， TBA ）酶循環測定（enzymatic cycIing method）

膽汁酸是3α-HSD的作用底物之一，隨著肝功能損傷程度濃度提高，臨床上用天然3α-HSD作為工具酶來測定人血清中的總膽汁酸濃度[20]。自從20世紀70 年代由睪丸酮叢毛單胞菌中提取到高純度3α-HSD后，TBA 酶法測定逐步發展起來。第四代的TBA 酶學測定方法是酶循環測定法[21-22]，用底物和輔酶的反復反應，使待測物的量隨時間的延長而不斷增加，從而提高了檢測靈敏度，且反應產物無污染，是一種非常有應用前景的測定方法（圖2）。研究人員[20，23]參考日本Asahi Chemical公司的有關資料，基于用脫氫酶-輔酶體系循環底物的原理，通過優化實驗，建立了靈敏度高，線性、精密度好，幾乎無干擾，血清總膽汁酸（TBA）測定的酶循環法，是一種理想的TBA測定方法。

但是，從前文可知，TBA 測定中所用的工具酶3α-HSD 均從睪丸酮叢毛單胞菌中直接提取而來，天然提取的諸多固有缺陷無法繞開[24]。這導致了國內以3α-HSD為核心成分的第四代TBA循環檢測技術在實際應用過程中，只能依靠從國外進口的昂貴試劑，在一定程度上限制了TBA 測定的臨床推廣。目前，隨著3α-HSD人工融合蛋白的原核表達技術日臻成熟，而融合蛋白的活性與天然3α-HSD基本相同，建立以融合蛋白為工具酶的血清TBA 酶學測定法的研究仍處于空白階段，從經濟價值和應用價值上來說都具有可觀的發展潛力，可作為下一階段的研究熱點。

3.2 3α-HSD轉基因體系的建立

將外源基因導入到生物基因組 DNA 中，并在生物體內穩定的遺傳，獲得具有特殊功能的生物是當前生物基因工程的主要研究熱點之一。研究人員先后將3α-HSD和aiiA基因以雙基因融合載體的形式通過農桿菌介導法轉入煙草和水稻中，檢測融合蛋白的表達和生物活性后發現目的蛋白含量顯著高于對照，獲得具有雙基因優點的煙草和水稻新種質[25-26]。Zhang等[27]通過農桿菌介導法將含有 3α-HSD 基因的載體導入到果蔗基因組DNA 中，獲得陽性植株。對轉 3α-HSD 基因的果蔗葉片進行 ELISA 檢測，檢測結果表明：3α-HSD 基因在轉基因果蔗基因組 DNA 中得到表達，3α-HSD 蛋白的表達量高于對照。轉基因果蔗的類固醇降解率高于對照，平均降解率達 80%左右，高于對照 25%左右。

為充分發揮3α-HSD對環境污染物中的類固醇化合物的降解作用，這些研究通過基因槍法等轉基因技術將含有 3α-HSD 基因的載體導入到植物基因組 DNA 中，獲得目的陽性植株。對轉基因植株進行類固醇降解實驗，與理論上預期效果完全一致，實際過程中轉基因陽性植物對于類固醇類物質的降解率明顯高于陰性對照。

3.3 利用3α-HSD單克隆抗體檢測環境或食品中類固醇類激素及獸藥殘留

關于類固醇類激素檢測的文獻報道較多[30-31]， 主要使用的常規檢測方法有高效液相色譜法、液/質聯用法、氣/質聯用法等。但液/質聯用法高昂的儀器和維護保養成本高、氣/質聯用法操作復雜、占用時間長[32]。試劑盒和酶聯免疫法只能針對單種成分等缺陷，使其在應用于大量樣品實施初篩和監測工作中受到了限制。因此，開發多殘留分析的高通量檢測對于大規模樣品檢測任務是迫切需要的。

在睪丸酮叢毛單胞菌降解甾醇類化合物類固醇的過程中，隨著甾體類激素等誘導劑濃度的提高，阻遏蛋白的被抑制程度隨之增加，而3α-HSD的翻譯表達量相應提高，在一定范圍內形成了與甾體類激素含量線性關系。C. testosterone 如作為在環境檢測中的指示菌種，通過ELISA 方法檢測其對3α-HSD蛋白的表達量，可以準確地對環境樣品中睪丸酮或類固醇類激素的定性以及定量檢測。3α-HSD 是作為降解甾體化合物的關鍵酶，在檢測中可作為目標蛋白為利用生物學方法檢測環境中類固醇類化合物的含量。研究人員[33]利用3α-HSD單克隆抗體，建立了水體或飼料中總甾體激素含量的雙抗夾心酶聯免疫反應（ ELISA）。當甾體激素的量在0.5～600 μg·g-1之間，與3α-HSD酶表達量具有明顯線性關系。

目前，為建立廣譜的激素篩查技術，筆者所在課題組在前文所述的高純度蛋白基礎上，已研制出高效價比的3α-HSD單克隆抗體。與傳統的HPLC技術在靈敏度方面進行比較，建立于高效價比基礎上的雙抗夾心ELISA法具有高靈敏度和高通量等特點，可以同時檢測睪丸酮及與其結構類似的一類物質的量。在樣品多成分檢測中，這種新型的甾體激素檢測方法雖然無法專一性檢測某種特定成分，但可用于監測環境中甾體激素污染整體情況和食物、飼料中類固醇類有害成分的快速初篩[34]。

4 結語與展望

由于人類工業革命的發展，大量的激素類化合物被排放到空氣、水、土壤中，自然環境承受多種污染破壞，農業生產和自然生態平衡面臨著巨大壓力。這些有毒化學物質通過食物鏈的轉移以及生活中直接接觸吸收等多種方式，直接或間接地威脅著處于食物鏈頂端的人類，包括雄酮等類固醇類激素物質誘導造成的癌癥、不孕癥等各類疾病，是人類健康的大敵[28-29]。由于3α-HSD是睪丸酮叢毛單胞菌（C. testosteroni）的關鍵酶，即具有脫氫降解功能又可以起到還原作用，尤其是經過改良后的各類工程菌在保證穩定性的前提下將具有廣泛的應用范圍。在環境修復領域，3α-HSD可在農業上作為飼料食品添加劑及含有芳類物質肥料的降解物.還可以消化雌性激素類物質及動植物分泌的生理活性物中難降解多環芳烴類和甾體類化合物，也可用于土壤、水源等環境因子的修復[35-36]。另外，在植物修復領域，根據植物通過吸收、降解以及根際圈降解等方式將徹底去除環境中污染物的功能，利用轉基因技術將睪丸酮叢毛單胞菌中的降解關鍵酶基因 3α-HSD 導入到植物中去，彌補植物缺乏微生物的有機物降解能力，具有處理費用相對低廉、對環境擾動少和資源可持續利用的特點，會進一步提高生物修復的實際應用價值。在檢測領域，通過制備高純度的3α-HSD抗原和相應的多克隆與單克隆抗體，進一步建立和完善能夠快速檢測多環芳烴類和甾體類化合物的免疫學方法將有望成為新的重點研究方向。

參考文獻：

[1] Talalay P，Doboson N D，TapIey D F. Oxidative degradation of testosterone by adaptive enzymes[J]. Nature，1952，170 （4 328）：620-62l.

[2] Boyer J， Baron D N， Talaly P. Purification and properties of 3α-hydroxysteroid dehydrogenase[J]. Biochemistry， 1965， 4 （19） ： 1 825-1 833.

[3] Mobus E， Maser E. Molecular cloning，overexpression and characterization of steroid-inducible 3α-hsdroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase from Comamonas testosterone， a novel member of the short-chain dehydrogenase/reductase superfamily[J]. Biol Chem，1998，273 （473）：30 888-30 896.

[4] Xiong G， Martin H J， Blum A，et al.A model on the regulation of 3α-hsdroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase expression from Comamonas testosterone[J]. Biol Chen，276（130-132）：961-970.

[5] Mobus E， Maser E. Cloning and sequencing of a new Comamonas testosteroni gene encoding 3 alpha- hydroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase[J]. Adv Exp Med Biol ， 1999， 463： 395-402.

[6] Browning D F， Busby S J W. The regulation of bacterial transcription initiation[J]. Nature Reviews.Microbiology， 2004，2（1）：57-65.

[7] Dai Y M， Zhou Y F， Xiong G M， et al. Expression of Activator from Comamonas testosteroni with tac promoter containing different 10 consensus sequences[J]. Journal of Agricultural Biotechnology， 2005， 13（6）：747-753.

[8] Dai Y M， Pan D R， Xiong G M， et al. Construction and over-expression of the activator gene from Comamonas testosteroni[J]. Journal of Agricultural Biotechnology， 2006，14（3）：416-422.

[9] Dai Y M， Zhou Y F， Chen J C， et al. Construction and stability analysis of the engineered Comamonas testosterone[J]. Journal of Agricultural Biotechnology， 2010，18（4）：807-814.

[10] Chen J Q， Pan D R， AI F Y， et al. TeiR-disrupted mutant of Comamonas testosteroni construction and its characteristics in steroid biodegradation[J]. Chin J Appl Environ Biol， 2009，15（6）：830-834.

[11] Pruneda-Paz J L， Linares M， Cabrera J E， et al. TeiR， a LuxR type transcription factor required for testosterone de gradation in Comamonas testosteroni[J]. Bacterio， 2004， 186（ 5） ： 1 430-1 437.

[12] Monferrer D， Tralau T， Kertesz M A， et al， Usón I.Structural studies on the full length LysR-type regulator TsaR from Comamonas testosteroniT-2 reveal a novel open conformation of the tetrameric LTTR fold[J]. Mol Microbio， 2010， 75（ 5） ： 1 199-1 214.

[13] Li M T， Wang Q S， Yu Y Y. Cloning of LysR gene from Comamonas testosteroni and its regulationfor expression of 3α-HSD/ CR in E. coli HB101[J]. Journal of Jilin Agricultural University，2011， 33（6）： 624-627.

[14] Jez J M，Bennett M J，Schlegel B P.Comparative anatomy of thealdo-keto reductase superfamily[J]. Biochem J，1997，326（3）：625-636.

[15] Joernvall H ， Persson B， Krook M， et al.Short-chain dehydrogenasea/ reductases （SDR） [J]. Biochemistry，1995，34（18）：6 003-6 013.

[16] Mobus E，Jahn M，Schmid R，et al.Testosterone-regulated expression of enzymes involved in steroid and aromatic hydrocarbon catabolism in Comamonas testosteroni[J]. Bacteriol， 1997，179（18）：5 951-5 955.

[17] Zhang G H， Cong A R， Xu G B.Isolation and identification of Comamonas testosteroni：Cloning and over expression of 3α-hydroxysteroid dehydrogenase in E. coli.[J]. Journal of Peking University（Health Sciences）， 2005，37（2）：203-206.

[18] Ke Y F， Lu G J， Hou L L， et al. Cloning and expression of 3α-hydroxysteroid dehydrogenase gene in E. coli[J]. Chinese Journal of Microecology， 2009， 21（9）：822-825.

[19] Xiao L， Xue Q， Zhou M Q， et al.Effective expression and purification of 3α-HSD protein from Comamonas testosterone[J]. Journal of China Agricultural University， 2013，18（1）：142-146.

[20] Xu Y， Yang C G. A method of the enzymatic cycling assay for total bile acids in serum[J]. Journal of Clinical Laboratory Science， 2002， 20（1）：11-12.

[21] Mashige F，Tanaka N，Maki A，et al. Direct spectrophotometry of totalbile acids in serum[J]. Clin Chem，1981，27（8）：1 352-1 356.

[22] Komiyama Y，Adachi T，Ito Y，et al. Microassay of serum bile acidsby an enzymatic cycling method[J]. Chem Pharm Bull，1982，30（10）：3 796-3 799.

[23] 鄒洪興，裘靖紅.酶循環法測定血清總膽汁酸[J].陜西醫學檢驗，1999，14（4）：35-36.

[24] SkaIhegg B A. On the 3α-hydroxysteroid dehydrogenase from Pseudomonas testosteroni purification and properties[J]. Eur J Biochem，1974，46（1）：117-125.

[25] Wang J J. Research on 3α-HSD/CR-aiiA gene co-transformation of rice by agrobacterium tumefaciens mediated method[D]. Fuzhou： FuJian Agriculture and Forestry University， 2012.

[26] Ying W W. Transformation of fuse gene 3α-HSD/CR- aiiA and two singal genes 3α-HSD/CR and aiiA in tobacco and expression analysis[D]. Fuzhou： FuJian Agriculture and Forestry University，2012.

[27] Zhang B B. Research on agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of gene 3α-HSD to chewing cane[D]. Fuzhou： FuJian Agriculture and Forestry University， 2012.

[28] Du K J， Xu X B. Advance in the research on environmental Etrogens[J]. Kexue Tongbao （Chinese Science Bulletin）， 2000， 45（21）： 2 241-2 251.

[29] Danzo B J. Environmental xenobiotics may disrupt normalendocrine function by interfering with the binding of physiological ligands to steroid receptors and binding proteins[J]. Environmental Health Perspectives， 1997，105（3）：294-301.

[30] Hauwea O V， Dumoulin F， Antignac J P， et al. Liquid chromatographic - mass spectrometric analysis of 11 glucocorticoid residues and an optimization of enzymatic hydrolysis conditions in bovine liver[J]. Analytica Chimica Acta， 2002， 473（1-2）： 127-134.

[31] Monica M. Effect of the systemic versus inhalatory administration of synthetic glucocorticoids on the urinary steroid profile as studied by gas chromatography-mass spectrometry[J]. Analytica Chimica Acta， 2006， 559（1）： 30-36.

[32] Chen X， Dong W F， Zhao J H， et al. Determination technology of residual anabolic steroid hormones [J]. Inspection and Quarantine Science， 2007，17（z1）：93-98.

[33] Yu Y H，Diao Y W，Ma D Z，et al. Expression and contection of 3-HSD in different bacteria by the induction of testosterone[J]. Journal of Changchun University of Science and Technology（Natural Science Edition），2007，30（4）：63-65.

[34] Ma D Z， Yang J X. ELISA detection of steroidal hormones in water resources，food and feed[J]. Chinese Journal of Applied Chemistry， 2010，27（12）：1466-1469.

[35] Maser E， Mobus E， Xiong G.Funcitonal expression，purification，and characterization of 3α-hsdroxysteroid dehydrogenase / carbonyl reductase from Comamonas testosterone[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2000， 272（2）：622-628.

[36] Maser E， Xiong G. 3α-hsdroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase from Comamonas testosterone： Biological significance，three-dimensional structure and gene regulation[J]. Chem Biol Interact，2001，130-132（1-3）： 707-722.

[31] Monica M. Effect of the systemic versus inhalatory administration of synthetic glucocorticoids on the urinary steroid profile as studied by gas chromatography-mass spectrometry[J]. Analytica Chimica Acta， 2006， 559（1）： 30-36.

[32] Chen X， Dong W F， Zhao J H， et al. Determination technology of residual anabolic steroid hormones [J]. Inspection and Quarantine Science， 2007，17（z1）：93-98.

[33] Yu Y H，Diao Y W，Ma D Z，et al. Expression and contection of 3-HSD in different bacteria by the induction of testosterone[J]. Journal of Changchun University of Science and Technology（Natural Science Edition），2007，30（4）：63-65.

[34] Ma D Z， Yang J X. ELISA detection of steroidal hormones in water resources，food and feed[J]. Chinese Journal of Applied Chemistry， 2010，27（12）：1466-1469.

[35] Maser E， Mobus E， Xiong G.Funcitonal expression，purification，and characterization of 3α-hsdroxysteroid dehydrogenase / carbonyl reductase from Comamonas testosterone[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2000， 272（2）：622-628.

[36] Maser E， Xiong G. 3α-hsdroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase from Comamonas testosterone： Biological significance，three-dimensional structure and gene regulation[J]. Chem Biol Interact，2001，130-132（1-3）： 707-722.

[31] Monica M. Effect of the systemic versus inhalatory administration of synthetic glucocorticoids on the urinary steroid profile as studied by gas chromatography-mass spectrometry[J]. Analytica Chimica Acta， 2006， 559（1）： 30-36.

[32] Chen X， Dong W F， Zhao J H， et al. Determination technology of residual anabolic steroid hormones [J]. Inspection and Quarantine Science， 2007，17（z1）：93-98.

[33] Yu Y H，Diao Y W，Ma D Z，et al. Expression and contection of 3-HSD in different bacteria by the induction of testosterone[J]. Journal of Changchun University of Science and Technology（Natural Science Edition），2007，30（4）：63-65.

[34] Ma D Z， Yang J X. ELISA detection of steroidal hormones in water resources，food and feed[J]. Chinese Journal of Applied Chemistry， 2010，27（12）：1466-1469.

[35] Maser E， Mobus E， Xiong G.Funcitonal expression，purification，and characterization of 3α-hsdroxysteroid dehydrogenase / carbonyl reductase from Comamonas testosterone[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2000， 272（2）：622-628.

[36] Maser E， Xiong G. 3α-hsdroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase from Comamonas testosterone： Biological significance，three-dimensional structure and gene regulation[J]. Chem Biol Interact，2001，130-132（1-3）： 707-722.