C型凝集素受體樹突細胞特異性捕獲細胞間黏附分子3非整合素細胞表達模型的構建及功能研究

張宇 姚煦 顧漢艷 王寶璽 劉軍

C型凝集素受體樹突細胞特異性捕獲細胞間黏附分子3非整合素細胞表達模型的構建及功能研究

張宇 姚煦 顧漢艷 王寶璽 劉軍

目的構建C型凝集素受體樹突細胞特異性捕獲細胞間黏附分子3非整合素(DC-SIGN)細胞表達模型,為后續進行DC-SIGN蛋白受體功能研究提供基礎。方法PCR擴增獲得DC-SIGN分子的cDNA,克隆入真核表達載體p巨細胞病毒啟動子-綠色熒光蛋白重組質粒(PCMV-EGFP),EGFP位于DCSIGN N末端,轉染人胚腎細胞癌HEK 293T細胞后,流式細胞儀檢測DC-SIGN重組分子的表達,激光共聚焦顯微鏡檢測DC-SIGN-EGFP融合蛋白的細胞定位情況,并進一步檢測轉染表達的DC-SIGN受體對過敏原抗原的識別和內吞過程。結果構建的熒光融合蛋白重組表達質粒,經PCR及Western印跡證明DC-SIGN表達成功;經流式細胞儀檢測轉染DC-SIGN融合質粒的HEK293T細胞的DC-SIGN受體表達量增多(約50%)。重組表達質粒轉染293T細胞后,激光共聚焦顯微鏡檢測顯示,綠色熒光標記的DC-SIGN位于細胞膜上,可結合紅色熒光素標記的過敏原抗原Derp2,并可將Derp2內吞入細胞內。 結論 構建的DC-SIGN-EGFP融合蛋白在293T細胞內表達后具有細胞表面受體分子的特征性分布,可被DC-SIGN特異性抗體識別并具有攝取過敏原功能,是研究DC-SIGN分子功能的理想細胞模型。

受體,有絲分裂原;重組融合蛋白質類;抗原,塵螨屬;細胞系,腫瘤

樹突細胞(DC)特異性捕獲細胞間黏附分子3非整合素(dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin,DC-SIGN)是新近發現的限制性表達于DC和某些組織巨噬細胞上的凝集素樣受體[1],由于胞外區糖識別域(CRD)可以特異性識別抗原的糖基結構,故其自然配體非常廣泛[2]。作為致病原受體,它可以與人類免疫缺陷病毒(HIV)、巨細胞病毒(CMV)、結核分枝桿菌和血吸蟲等靶向結合,且大多數致病原與該受體靶向結合后的事件均與病情進展密切相關[1,3-4]。鑒于DCSIGN的DC限制性表達的特性和作為抗原受體的功能特點,推測DC-SIGN同樣是富含多糖的過敏原抗原的靶受體。為了解DC-SIGN對過敏原抗原結合能力及內吞和提呈功能,我們構建DC-SIGN熒光融合蛋白真核表達質粒,轉染工程細胞系人胚腎細胞癌HEK293T細胞獲得瞬時表達,并以激光共聚焦顯微鏡和流式細胞儀等技術鑒定熒光融合蛋白的表達和功能。

材料與方法

一、材料

大腸桿菌DH5α(日本TaKaRa公司),DC-SIGN+pMD18-T質粒(北京義翹神州技術有限公司),p巨細胞病毒啟動子-綠色熒光蛋白重組質粒(PCMVEGFP,上海吉瑪技術有限公司),HEK 293T細胞株(美國模式菌種收集中心ATCC),Ex Taq酶、Pyrobest DNA Polymerase、T4 DNA 連接酶、HindⅢ和 BamHⅠ內切酶、質粒抽提試劑盒和DNA回收試劑盒(日本TaKaRa公司),BCA蛋白質定量試劑盒(上海碧云天生物技術公司),轉染試劑陽離子脂質體Lipofectamine2000(美國Invitrogen公司),小鼠抗人DC-SIGN(美國Abcam公司),Alexa Fluor-647熒光染料(美國Invitrogen公司)。其余試劑均為國產分析純。

二、方法

1.PCR方法得到DC-SIGN序列片段:PCR反應體系參照日本TaKaRa公司Ex Taq酶說明書,設50 μl體系。 DC-SIGN:上游引物:5'-GATATAAGCT TGCCACCATGAGTGACTCCAAGGAACCAAGACTG CA-3',下游引物:5'-GTATCGGATCCCTACGCAGG AGGGGGGTTTGGGGTG-3'。PCR反應條件:95℃變性3 min,94℃30 s,55℃30 s,72℃30 s,30個循環;最后72℃延伸5 min。PCR反應完成后,利用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收DC-SIGN基因片段。

2.重組DC-SIGN分子的克隆及鑒定:按照TaKaRa公司T4 DNA連接酶的說明,將PCMVEGFP質粒和DC-SIGN基因片段用HindⅢ和BamHⅠ酶切,10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后回收DC-SIGN基因片段和載體PCMV-EGFP。用T4 DNA連接酶連接雙酶切得到的DC-SIGN基因片段和線性化的載體,22℃連接2 h。連接產物轉化DH5α感受態細菌,分別以卡那霉素篩選,挑取單克隆抗性菌落擴增,小量抽提質粒并做酶切鑒定在1 215 bp對應區域有條帶為陽性克隆,質粒送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。構建成功的質粒圖譜見圖1。

3.真核表達質粒轉染HEK 293T細胞:按照陽離子脂質體Lipofectamine說明書將構建的兩個真核表達質粒轉染HEK293T細胞,以PCMV空載體為對照。用DMEM培養基(含10%胎牛血清,不含青、鏈霉素)將HEK293T細胞形成單細胞懸液,按照每孔5×105個細胞接種于12孔細胞培養板,37℃5%CO2培養24 h細胞貼壁并達80%～90%融合時,用3 ml D-Hanks液洗滌細胞2次,加入1 ml DMEM培養基。用不完全DMEM培養基配轉染試劑Lipofectamine及重組質粒,每孔加入 2 μl Lipofectamine 于 50 μl DMEM,0.89 μg質粒 DNA 于50 μl DMEM,質粒與脂質體終濃度比為 1 μg ∶2.25 μl。將兩試劑室溫混合20 min,將轉染混合物逐滴加入已鋪好細胞的12孔板中混勻后,5%CO237℃培養過夜,轉染48 h觀察結果。

4.激光共聚焦顯微鏡檢測重組DC-SIGNEGFP融合蛋白的表達:將轉染48 h的HEK293T細胞收集,PBS洗1次,按DC-SIGN磁珠分選(德國Miltenyi Biotic公司)說明書步驟,分離表達CD209受體的HEK293T細胞,將其繼續培養12 h。4%多聚甲醛固定30 min;4',6-二瞇基-2-苯基吲哚(DAPI)避光染色10 min后激光共聚焦顯微鏡檢測熒光融合蛋白的表達。

圖1 重組PCMV-EGFP-DC-SIGN質粒圖譜 PCMV-EGFP:p巨細胞病毒啟動子-綠色熒光蛋白質粒;DC-SIGN:樹突細胞特異性捕獲細胞間黏附分子3非整合素

5.PCR和Western印跡檢測DC-SIGN基因及蛋白的表達:HEK293T細胞轉染48 h后,收集細胞,用TRIzol試劑提取總mRNA,反轉為cDNA后,用小片段DC-SIGN產物驗證DC-SIGN表達。小片段DC-SIGN:上游引物5'-AAGTAACCGCTTCACCT GGATGG-3',下游引物5'-GGCAAGATTACATTTGT CGTCGTT-3';內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH):上游引物5'-AGAAGGCTGGGGCTCAT TTG-3',下游引物5'-AGGGGCCATCCACAGTCTT C-3'。 PCR反應條件:95℃變性3 min;94℃30 s,55℃30 s,72℃30 s,30個循環;最后72℃延伸5 min。PCR反應完成后,利用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察擴增條帶。另一部分細胞用PBS洗滌2次,用RIPA裂解液以及蛋白酶抑制劑和1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF,美國Sigma公司)抽提總蛋白,按BCA蛋白質定量試劑盒確定樣品蛋白濃度。將蛋白依次上樣后,轉移PVDF膜,膜在2%BSA溶液中室溫孵育1 h以封閉非特異性結合,應用終濃度為1.5 mg/L小鼠抗人DC-SIGN一抗孵育1.5 h,TBST緩沖液洗滌后加入過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG(1∶500)與一抗結合,室溫孵育1 h,增強化學發光法(ECL)試劑作用后ChemiDocXRS系統顯影拍照。分析DCSIGN蛋白表達情況。

6.激光共聚焦顯微鏡檢測融合蛋白對戶塵螨過敏原的攝取:收獲轉染后48 h的HEK293T細胞。根據說明書步驟用新型熒光染料Alexa Fluor-647(Molecular Probes)標記nDer p 2天然純化過敏原(美國Indoor Biotechnologies公司),標記后蛋白終濃度為0.6 g/L。加入20 mg/L Alexa Fluor-647標記的nDer p 2過敏原在37℃分別孵育15 min和45 min;用4%多聚甲醛固定25 min,PBS洗3次,加入DAPI核染色劑避光孵育10 min,用激光共聚焦顯微鏡檢測熒光融合蛋白的表達。

結 果

一、EGFP-DC-SIGN融合基因表達載體的構建

PCR方法得到帶有HindⅢ和BamHⅠ酶切位點的1 215 bp的DC-SIGN全長編碼框,酶切后連接入PCMV-EGFP真核表達載體,構建出熒光蛋白位于DC-SIGN蛋白N末端的融合蛋白表達質粒PCMV-EGFP-DC-SIGN。將構建的重組質粒PCMVEGFP-DC-SIGN用HindⅢ和BamHⅠ酶切,電泳后得到2條片段,位置與理論值一致(1條為1 200 bp,1條為線性載體片段4 700 bp),說明克隆成功。將質粒送life公司測序,測序結果與DC-SIGN序列一致。

二、DC-SIGN熒光融合蛋白的表達

在HEK-293T細胞表達Lipofectamine2000陽離子脂質體轉染重組質粒48 h后,激光掃描共聚焦顯微鏡檢測到有綠色熒光表達,提示EGFP-DCSIGN融合蛋白表達質粒在HEK293T細胞中表達(圖2)。小片段DC-SIGN擴增產物證實了DC-SIGN的表達(圖3)。PCR反應完成后,瓊脂糖凝膠電泳觀察到280 bp處出現擴增條帶。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析顯示,在相對分子質量44 000處有條帶,證明DC-SIGN有表達。流式細胞儀檢測顯示,轉染EGFP-DC-SIGN融合蛋白表達質粒后,HEK293T細胞DC-SIGN表達率為78.89%,較未轉染細胞(29.00%)上升近50%,表達(熒光)強度上升54.6%(1 063比483)。

三、DC-SIGN融合蛋白對戶塵螨過敏原的攝取能力

見圖4。在過敏原加入HEK293T細胞后15 min,有熒光素標記的過敏原結合于膜表面的DC-SIGNEGFP融合蛋白上。培養時間增至45 min時,熒光素標記的過敏原逐漸分布至細胞內部。當細胞預先用封閉性抗體DC-SIGN孵育30 min后,在45 min內未見過敏原結合及內吞。

圖2 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測HEK293T細胞轉染PCMV-EGFP-DC-SIGN重組質粒 2a:48 h后,細胞膜上綠色熒光(×400);2b:DAPI染色細胞核呈藍色(×200);2c,2d:HEK293T細胞膜上有綠色熒光蛋白表達(×200) PCMV-EGFP:p巨細胞病毒啟動子-綠色熒光蛋白質粒;DC-SIGN:樹突細胞特異性捕獲細胞間黏附分子3非整合素

討 論

DC是專職性抗原提呈細胞,是機體免疫應答的始動者,其表面表達的多種模式識別受體備受關注。其中,特異性識別富含糖基結構抗原的C型凝集素受體是DC表面的一大類重要的模式識別受體[5]。研究發現,DC-SIGN在介導病原微生物致病和腫瘤免疫逃逸等方面發揮作用[5-6]。DC-SIGN屬Ⅱ型跨膜蛋白,其C末端位于胞外區,而N末端位于胞內區,胞外區CRD蛋白表面的兩個環形突起形成2個Ca2+結合位點:一個在CRD構型及協調其結合糖類配體中發揮重要作用;另一個在糖類配體結構的空間定位上起關鍵作用。CRD可識別結合含甘露糖以及含巖藻糖成分病原體或過敏原。胞質結構域主要包括一些內化基序[7]。體外結合試驗顯示,DC-SIGN受體可與多種富含多糖結構的過敏原抗原特異性結合。但是體外結合試驗不能代表活體細胞真實情況,本實驗進行DC-SIGN細胞表達模型的構建,旨在為后續進行功能研究提供細胞模型。

圖3 PCR檢測轉染后HEK293T細胞中樹突細胞特異性捕獲細胞間黏附分子3非整合素(DC-SIGN)的表達 M:標準參照物;1:DC-SIGN小片段驗證產物,約280 bp;2:甘油醛-3-磷酸脫氫酶內參照

圖4 樹突細胞特異性捕獲細胞間黏附分子3非整合素(DCSIGN)受體對Alexa Fluor-647標記的nDer p 2過敏原的結合和內吞(×800) 4a:4b～4d的重疊圖;4e:4f～4h的重疊圖。藍色熒光為4',6-二瞇基-2-苯基吲哚染色標記定位細胞核,綠色熒光代表DCSIGN受體表達于細胞膜表面,紅色熒光代表Der p 2過敏原

構建熒光融合表達蛋白是進行分子細胞內示蹤的常見方法,但必須使重組質粒獲得表達后仍然具有天然分子分布特征和生物學功能。文獻報道[8],將熒光蛋白EGFP置于DC-SIGN的C末端可能會影響DC-SIGN對配體的識別,故我們將EGFP置于DC-SIGN的N末端構建熒光融合蛋白重組表達質粒,經PCR及Western印跡檢測證明DC-SIGN表達成功;經流式細胞儀檢測DC-SIGN受體表達增高。HEK293T細胞系是常見的工程細胞,微弱或不表達Toll樣受體,少量表達C型凝集素受體,故我們選擇HEK293T細胞系為轉染細胞。轉染后發現,DC-SIGN的表達水平增加50%,可用來作為DCSIGN細胞模型來進行后續功能研究。

本研究證實,融合蛋白表達后綠色熒光主要位于細胞膜上,流式細胞儀檢測轉染DC-SIGN融合質粒的HEK293T細胞DC-SIGN受體表達量增多,表達融合DC-SIGN蛋白在15 min時可結合紅色熒光標記的Derp2抗原,后者與融合蛋白的綠色熒光有較好的共聚現象,45 min觀察時紅色熒光已經內吞進入胞內,紅色熒光與核染色的藍色熒光出現共聚現象。

[1]Geijtenbeek TB,Den Dunnen J,Gringhuis SI,et al.Pathogen recognition by DC-SIGN shapes adaptive immunity[J].Future Microbiol,2009,4(7):879-890.

[2]Lee RT,Hsu TL,Huang SK,et al.Survey of immune-related,mannose/fucose-binding C-type lectin receptors reveals widely divergent sugar-binding specificities[J].Glycobiology,2011,21(4):512-520.

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2013-09-02)

(本文編輯:尚淑賢)

A cellular model for the expression of the C-type lectin dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin:construction and functional analysis

Zhang Yu*,Yao Xu,Gu Hanyan,Wang Baoxi,Liu Jun.*Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China

s:Yao Xu,Email:dryao_xu@126.com;Liu Jun,Email:drliu_jun@126.com

ObjectiveTo establish a cellular model for the expression of the C-type lectin dendritic cellspecific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin (DC-SIGN),and to provide a basis for the functional analysis of DC-SIGN.MethodsThe cDNA of DC-SIGN was obtained via PCR,and cloned into the eukaryotic expression vector porcine cytomegalovirus-enhanced green fluorescent protein(PCMV-EGFP)with EGFP at the N terminal of DC-SIGN.Then,the recombinant PCMV-EGFP-DC-SIGN plasmid was transfected into HEK293T cells followed by the detection of DC-SIGN expression using PCR,Western blot and flow cytometry.Confocal microscopy was performed to localize the expression of DC-SIGN-EGFP and visualize the recognization and internalization of the Derp2 allergen by DC-SIGN.ResultsThe recombinant fluorescent fusion protein-expressing plasmid was successfully constructed.Both PCR and Western blot confirmed the expression of DC-SIGN.Flow cytometry showed that the expression of DC-SIGN was increased by approximately 50%in HEK293T cells transfected with the recombinant expression plasmid compared with those untransfected.As confocal microscopy showed,the green fluorescence-labelled DC-SIGN was located on the cell membrane,which could bind to the red fluorescence-labelled antigen Derp2 and internalize it into the cells.ConclusionsThe recombinant DC-SIGNEGFP fusion protein is characteristically located on the surface of 293T cells,which can be recognized by the DCSIGN-specific antibody and is capable of internalizing the allergen Derp2,and may serve as an ideal cell model for further studies on molecular function of DC-SIGN.

Receptors,mitogen;Recombinant fusion proteins;Antigens,dermatophagoides;Cell line,tumor

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.07.002

國家自然科學基金(81171501);江蘇省自然科學基金(BK2011127)

210042南京,中國醫學科學院北京協和醫學院皮膚病研究所(張宇、姚煦、顧漢艷、王寶璽);南京大學醫學院附屬鼓樓醫院皮膚科(劉軍)

姚煦,Email:dryao_xu@126.com;劉軍,Email:drliu_jun@126.com