轉(zhuǎn)化生長因子β對A431細胞上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)換相關(guān)分子表達的影響

郭圓圓 彭斌 向桂瓊 耿松梅

轉(zhuǎn)化生長因子β對A431細胞上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)換相關(guān)分子表達的影響

郭圓圓 彭斌 向桂瓊 耿松梅

目的研究轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)對人表皮鱗狀細胞癌A431細胞上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)相關(guān)分子表達的影響。方法用含7.5 μg/L TGF-β處理A431細胞72 h后觀察細胞形態(tài),采用實時定量PCR和Western印跡分別在mRNA水平和蛋白水平檢測EMT相關(guān)基因E鈣黏著蛋白、N鈣黏著蛋白、波形蛋白、β聯(lián)蛋白表達水平的變化。未經(jīng)TGF-β處理的A431細胞為對照組。結(jié)果TGF-β處理后,A431細胞獨立分散,呈梭形。實時定量PCR結(jié)果顯示,E鈣黏著蛋白表達量為未經(jīng)TGF-β處理組的31.7%,N鈣黏著蛋白、波形蛋白、β聯(lián)蛋白表達量分別為未經(jīng)處理組的2.475、11.340、2.615倍;Western印跡結(jié)果,N鈣黏著蛋白、波形蛋白、β聯(lián)蛋白表達量上升,E鈣黏著蛋白表達量下降。結(jié)論TGF-β可誘導A431細胞產(chǎn)生EMT現(xiàn)象,TGF-β表達量上升,可能參與表皮鱗狀細胞癌發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移。

細胞系,腫瘤;轉(zhuǎn)化生長因子β;上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化

上皮向間質(zhì)的轉(zhuǎn)換(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)是指上皮細胞在一定條件下,以一定的順序丟失極性,失去細胞之間的緊密連接及黏附連接,在形態(tài)上轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細胞樣,并通過蛋白酶破壞基底膜,從而獲得侵襲性與游走能力的現(xiàn)象[1]。近年來,EMT現(xiàn)象在大腸癌[2]、乳腺癌[3-4]、前列腺癌[5]等多種腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移中起到的作用已得到證實,而鱗狀細胞癌(SCC)為我國最常見的表皮腫瘤,較易發(fā)生轉(zhuǎn)移,其侵襲和轉(zhuǎn)移是否與EMT相關(guān)至今鮮有研究。轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)是一組新發(fā)現(xiàn)的可由機體多種細胞分泌產(chǎn)生的細胞因子,一般在分化活躍的細胞表達量較高,如腫瘤細胞、成骨細胞、胚胎的造血細胞等[6-7],被認為可能與EMT的發(fā)生相關(guān)[8]。那么,TGF-β是否可以誘導人表皮SCC A431細胞產(chǎn)生EMT現(xiàn)象并使其具有更強的侵襲及轉(zhuǎn)移能力呢?為此,我們觀察TGF-β處理A431細胞后的形態(tài),并采用實時定量PCR和Western印跡技術(shù)分別在mRNA水平和蛋白水平檢測EMT相關(guān)基因E鈣黏著蛋白(E-cadherin)、N鈣黏著蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、β聯(lián)蛋白(βcatenin)在TGF-β處理的A431細胞中的表達水平。

材料與方法

一、材料

1.細胞來源:人表皮SCC A431細胞來自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

2.主要試劑:重組人TGF-β(美國Peprotech公司),胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Hyclone公司),胰蛋白酶(美國Gibco公司),鼠抗人E鈣黏著蛋白、N鈣黏著蛋白、波形蛋白、β聯(lián)蛋白、β肌動蛋白單克隆抗體(美國Santa Cruz公司),山羊抗鼠二抗(美國Abcam公司),放射免疫共沉淀(RIPA)裂解液(美國Roche公司),RNAfast200總RNA極速抽提試劑盒(上海飛捷生物技術(shù)公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司),Perfect Real Time試劑盒(日本TaKaRa公司)。

3.主要儀器:JS-380A自動凝膠圖像分析儀(上海培清科技公司),SP-1000紫外分光光度計(美國Eppendorf公司),實時定量PCR儀(美國ABI公司)。

二、方法

1.細胞培養(yǎng):A431細胞為貼壁生長細胞,培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基,置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中以5%CO2飽和濕度條件培養(yǎng),隔天換液。

2.藥物干預:加藥組:選取對數(shù)生長期A431細胞饑餓過夜,用不含胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋TGF-β原液至7.5 μg/L[9],培養(yǎng)A431細胞72 h。對照組:用不含胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)同代細胞72 h。在倒置光學顯微鏡下觀察加藥組與對照組細胞形態(tài)及細胞間連接情況等,并拍照。

3.實時定量PCR:參照總RNA極速抽提試劑盒說明書提取加藥組與對照組細胞總RNA,并采用SP-1000紫外分光光度計測定A260/A280比值,以判定RNA純度。參照Takara公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明,采用10 μl反應體系,按37℃ 15 min,85℃ 5 s條件進行逆轉(zhuǎn)錄反應,所得產(chǎn)物用于實時定量PCR。檢索NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫獲得相關(guān)基因序列,實時定量PCR反應引物由寶生物工程(大連)有限公司設(shè)計并合成(表1)。20 μl反應體系內(nèi)含有cDNA模板 2 μl,2 × SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10 μl,ROX Reference Dye 0.4 μl,上游引物0.8 μl,下游引物0.8 μl,DEPC水6 μl。擴增條件為第1步95℃ 30 s,第2步95℃5 s、60℃31 s,共重復40個循環(huán),第3步95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s。 以 2-ΔΔCt表示加藥組與對照組目的mRNA表達的倍數(shù)關(guān)系。公式如下:ΔΔCt=[Ct(目的基因)-Ct(GAPDH)]加藥組 -[Ct(目的基因)-Ct(GAPDH)]對照組。

4.Western印跡檢測E鈣黏著蛋白、N鈣黏著蛋白、波形蛋白、β聯(lián)蛋白的表達:參照RIPA裂解液說明書分別提取加藥組與對照組細胞總蛋白,并采用SP-1000紫外分光光度計測定A260/A280比值,驗證蛋白純度。在蛋白內(nèi)加入少量上樣緩沖液,煮沸5 min。將蛋白以10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳(SDS-PAGE),分別切下目的蛋白質(zhì)所在位置凝膠進行轉(zhuǎn)膜,將硝酸纖維素濾膜放入含吐溫Tris緩沖生理氯化鈉溶液(TBST)配制的5%脫脂奶粉封閉液中,37℃溫育2 h,硝酸纖維素濾膜與相應鼠抗人一抗抗體工作液共同4℃孵育過夜,TBST洗膜液漂洗3次,二抗孵育1 h,TBST洗膜液漂洗3次,加入發(fā)光劑,于自動凝膠圖像分析儀下調(diào)節(jié)發(fā)光時間并拍照。

表1 實時定量PCR引物序列

結(jié) 果

一、TGF-β處理對A431細胞形態(tài)的影響

倒置光學顯微鏡下觀察:以不含TGF-β的無胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的A431細胞整體輪廓呈鋪路石樣,聚集呈團塊狀,細胞呈鵝卵石形或多角形,胞質(zhì)透亮(圖1a);在含7.5 μg/L TGF-β的無胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h后,可見細胞呈梭形,細胞間隙增大,細胞獨立不融合(圖1b)。

二、TGF-β處理對A431細胞EMT相關(guān)基因mRNA表達的影響

利用上述E鈣黏著蛋白、N鈣黏著蛋白、波形蛋白、β聯(lián)蛋白及GADPH引物擴增的基因片段,其熔解曲線具有擴增的一致性,PCR擴增呈指數(shù)生長且具有平臺期。加藥組E鈣黏著蛋白表達量為對照組的31.7%,N鈣黏著蛋白、波形蛋白、β聯(lián)蛋白表達量分別為對照組的2.475、11.340、2.615倍。

三、TGF-β處理對A431細胞EMT相關(guān)基因蛋白表達的影響

經(jīng)檢測N鈣黏著蛋白、波形蛋白、β聯(lián)蛋白表達量上升,E鈣黏著蛋白表達量下降,與mRNA表達量變化一致(圖2)。

圖1 轉(zhuǎn)化生長因子β處理A431細胞前后細胞形態(tài)比較(×400) 1a:對照組,細胞呈鵝卵石樣,團塊狀分布;1b:轉(zhuǎn)化生長因子β處理組,細胞呈梭形,分散呈單個分布

圖2 Western印跡檢測A431細胞上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因蛋白表達 1:對照組;2:轉(zhuǎn)化生長因子β處理組

討 論

最初,人們發(fā)現(xiàn)EMT現(xiàn)象時,認為它是胚胎發(fā)育過程中胚胎發(fā)生形態(tài)學變化的重要因素[7]。然而,隨著對EMT現(xiàn)象研究的深入,人們越來越關(guān)注EMT現(xiàn)象在早期腫瘤向侵襲性腫瘤及腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移過程中起到的作用[10-12]。EMT現(xiàn)象的發(fā)生總是伴隨著上皮相關(guān)的基因水平下調(diào)及間質(zhì)相關(guān)的基因水平上調(diào)。如參與上皮細胞間的黏附連接并維持上皮細胞極性的E鈣黏著蛋白的下調(diào)及間質(zhì)細胞特異性的波形蛋白、N鈣黏著蛋白的表達上調(diào)等[13]。而在腫瘤團塊中,這些基因的表達改變,引起腫瘤細胞間緊密連接及黏附連接丟失、細胞骨架破壞,導致細胞頂端變窄、基底膜帶結(jié)構(gòu)紊亂,使腫瘤細胞溢出基底膜帶向周圍遷徙并進入血管、淋巴管等發(fā)生轉(zhuǎn)移[14]。

有研究表明,上皮樣腫瘤細胞表達E鈣黏著蛋白,不具有穿透Marigel(一種包含膠原、蛋白多糖、細胞因子及多種酶類并模仿機體細胞膜的物質(zhì))的能力;而纖維細胞樣腫瘤細胞E鈣黏著蛋白表達量低,可以穿透Marigel,將E鈣黏著蛋白的cDNA轉(zhuǎn)染到此類細胞中,其侵襲能力受到抑制。說明纖維細胞樣腫瘤細胞可能是由上皮樣腫瘤細胞E鈣黏著蛋白表達量下降轉(zhuǎn)化而來[10]。如果發(fā)現(xiàn)了刺激這種轉(zhuǎn)化的因素,有可能推斷腫瘤惡性程度升高的原因。

近來研究提出,當機體受到TGF-β刺激后,可能可以通過TGF-β-Smad信號通路及TGF-β-non-Smad信號通路誘發(fā)EMT現(xiàn)象,進而引起ZO-1、波形蛋白等表達上調(diào),E鈣黏著蛋白等表達下調(diào)等,從而使上皮來源的腫瘤細胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細胞,細胞間的黏附能力下降,造成腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[15]。

本課題組利用人表皮SCC細胞系A(chǔ)431細胞,觀察TGF-β處理組細胞與未經(jīng)TGF-β處理組細胞的形態(tài)變化及EMT相關(guān)基因表達的變化。發(fā)現(xiàn)經(jīng)TGF-β處理,A431細胞在形態(tài)上向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化、細胞間隙增寬,在mRNA及蛋白水平上發(fā)生E鈣黏著蛋白表達量下降,N鈣黏著蛋白、波形蛋白、β聯(lián)蛋白表達量上升現(xiàn)象,符合發(fā)生EMT現(xiàn)象的變化。推測TGF-β的確是刺激人表皮鱗狀細胞癌腫瘤細胞內(nèi)在構(gòu)成性信號通路發(fā)生變化,發(fā)生EMT現(xiàn)象,從而使其具有更強的侵襲及轉(zhuǎn)移能力。抑制TGF-β與其受體的結(jié)合為降低SCC的惡性程度提供了一種新的思路。

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2013-09-04)

(本文編輯:尚淑賢)

Effects of transforming growth factor-β on the expressions of epithelial-to-mesenchymal transition-related molecules in A431 cells

Guo Yuanyuan,Peng Bin,Xiang Guiqiong,Geng Songmei.Department of Dermatology,Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710004,China

Geng Songmei,Email:gsm312@yahoo.com

ObjectiveTo evaluate the effect of transforming growth factor-β(TGF-β)on the expressions of epithelial-to-mesenchymal transition(EMT)-related molecules in human A431 epidermal squamous cell carcinoma cells.MethodsCultured A431 cells were classified into two groups:TGF-β group treated with TGF-β of 7.5 μg/L for 72 hours,and control group remaining untreated.Subsequently,cell morphology was observed under an inverted microscope,and real time-PCR and Western blot were performed to quantify the mRNA and protein expressions of EMT-related molecules including E-cadherin,N-cadherin,vimentin and β-catenin respectively.ResultsAfter TGF-β treatment,the cells became dispersed and spindle in shape.The mRNA expression levels of E-cadherin,N-cadherin,vimentin,and β-catenin in TGF-β group were 0.317,2.475,11.340 and 2.615 folds those in the control group respectively.Western blot showed a marked increase in the expression of N-cadherin,vimentin,and β-catenin proteins but a notable decrease in that of E-cadherin in the TGF-β group compared with the control group.ConclusionsTGF-β can induce EMT in A431 cells,and increased expression of TGF-β may contribute to the invasion and metastasis of SCC.

Cell line,tumor;Transforming growth factor beta;Epithelial-to-mesenchymal transition

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.07.010

國家自然科學基金面上項目(81372912);教育部新世紀人才支持計劃(NCET-10-0673);西安交通大學第二附屬醫(yī)院基金[YJ(ZD)201219]

710004西安交通大學第二附屬醫(yī)院皮膚科

耿松梅,Email:gsm312@yahoo.com