大疤性類天疤瘡患者皮損中CXCR5的表達及意義

楊敏 朱英華 崔紅艷 趙巖 王繪翔

大疤性類天疤瘡患者皮損中CXCR5的表達及意義

楊敏 朱英華 崔紅艷 趙巖 王繪翔

目的檢測濾泡輔助性T細胞(Tfh)趨化因子受體5(CXCR5)在大疤性類天疤瘡患者皮損中的表達,分析和探討CXCR5在大疤性類天疤瘡發病機制中的作用。方法應用免疫組化法檢測16例大疤性類天疤瘡患者皮損及10例健康人皮膚中CXCR5的表達。結果CXCR5在健康人皮膚表達于基底細胞層,主要表達于細胞質、細胞膜處;在大疤性類天疤瘡皮損中表達于基底細胞層與棘細胞層。CXCR5在健康人皮膚中陽性細胞表達均數為11.16±4.47,在大疤性類天疤瘡患者皮損中為35.70±12.20,兩組差異有統計學意義(t=6.07,P＜0.01)。結論CXCR5可能參與大疤性類天疤瘡的發病。

類天疤瘡,大疤性;受體,趨化因子;濾泡性T輔助細胞

大疤性類天疤瘡(bullous pemphigoid,BP)的發病機制目前仍未完全明確,比較成熟的理論[1]認為,抗原抗體結合形成免疫復合物沉積在基底膜帶透明板部位,激活補體經典途徑,誘導和產生多種細胞因子和炎癥介質,使錨絲和半橋粒斷裂形成表皮下水疤。盡管目前研究證實,大多數患者血清及組織中存在抗皮膚基底膜(BMZ)自身抗體[2],但對于自身抗體產生機制仍了解較少[3]。近年研究認為,濾泡輔助性T細胞(follicular helper T cell,Tfh)是直接輔助B細胞在生發中心(germinal centre,GC)產生高親和力抗體的T細胞亞群[4],趨化因子受體5(CXCR5)是Tfh特異性表面標志。我們應用免疫組化方法觀察CXCR5在BP患者皮損中的表達特點,探討Tfh與BP的發病是否相關。

一、臨床資料

收集并選取大連市皮膚病醫院2009年1月至2012年1月,16例BP住院患者的石蠟包埋組織,所有病例均依據病史、臨床表現、組織病理、免疫熒光(direct immunofluorescence,DIF)等檢查明確診斷為BP[1]。其中女9例,男7例,年齡58～91(73.18±8.90)歲。10例健康人對照皮膚取自我院整形外科手術切除的健康成人軀干、四肢皮膚,年齡44～71(61.50±9.62)歲。

二、方法

1.主要試劑:兔抗人CXCR5單克隆抗體(cat.#6558-1,美國Abcam公司),工作濃度為1∶120;抗兔免疫組化染色試劑盒(SP-9000/9001/9002)、DAB試劑盒(ZLI-9017/9018/9019,北京中杉金橋技術有限公司)。

2.實驗方法:采用免疫組化SP法,將石蠟包埋組織制成4.5 μm厚的切片,參照試劑盒說明步驟,常規脫蠟至水,微波修復抗原,以3%過氧化氫孵育15 min,山羊血清封閉15 min,滴加一抗4℃孵育過夜,滴加二抗孵育15 min,DAB顯色,蘇木素復染,脫水,透明中性樹脂膠封片。以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。

3.免疫組化結果判定:切片內陽性細胞計數方法見文獻[5],所有免疫組化染片背景清晰,陽性產物均呈棕黃色,陰性對照不著色。觀察陽性細胞分布區域及數量、強弱等。光鏡下觀察并統計每100個細胞中陽性細胞的數量,最后計算出5個高倍視野(×400)陽性細胞的平均值作為CXCR5表達。

4.統計學分析:應用SPSS13.0軟件包,所有結果均以±s表示,采用成組樣本均數t檢驗進行比較。

三、結果

1.CXCR5的表達部位:BP患者皮損及健康人皮膚中CXCR5僅表達于表皮層,真皮層、皮下組織中未見表達。健康人皮膚中CXCR5只表達在表皮基底細胞層中,細胞質、細胞膜上均可見棕黃色顆粒;BP皮損中CXCR5在水疤的疤頂及疤周圍表皮均有表達,且不單純表達于基底細胞層,還表達于棘細胞層達中上部(圖1)。

2.CXCR5在BP患者及健康人皮膚中的表達數量:16例BP皮損組織中CXCR5有1例陰性,15例陽性;在10例健康人皮膚中CXCR5有1例陰性,9例陽性。BP皮損中陽性細胞表達數為35.70±12.20,健康人皮膚為11.16±4.47,BP患者表達數量較健康人皮膚顯著增加(t=6.07,P＜0.01)。

四、討論

Tfh參與自身免疫性疾病發病機制的作用一直是國內外學者的研究熱點。2000年Schaedi等[6]和 Breitfeld 等[7]同時分別報道了Tfh,并對其在機體的功能及作用進行了深入研究,確立了Tfh是一個獨立的CD4+T輔助亞群,在機體參與細胞的免疫活動中起重要的作用。Fazilleau等[8]通過實驗證明,在Tfh表面,TCR與MHC-1Ⅰ類分子之間的親和力較其他亞群高,在特異性親和力已知的競爭環境中與抗原具有更高的親和力。

Tfh主要特征是持續表達CXCR5,CXCR5是一種G蛋白偶聯的七次跨膜受體,屬于趨化因子受體家族[9]。Barella等[10]研究認為,CXCR5在細胞免疫循環中屬于高表達的趨化因子受體,其高表達CD4+和CD8+T細胞和單核細胞,在細胞免疫中起到重要的調節作用,在生發中心內直接輔助B細胞的增殖、分化及抗體產生,維持機體初始免疫應答、再次免疫應答。在一些典型的自身免疫性疾病[11-14]如系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、1型糖尿病患者中,Tfh不僅大量積聚于脾臟和淋巴結,也是病變組織中淋巴濾泡即異位淋巴濾泡的重要組分,是上述疾病中輔助抗體產生的致病性T細胞。

我們在實驗中選取16例BP患者皮損與10例健康人皮膚,應用免疫組化法檢測CXCR5的表達情況。結果顯示,BP患者及健康人皮膚中均有CXCR5的表達,但僅表達于表皮層,真皮層、皮下組織中未見表達,健康人皮膚中CXCR5只表達在表皮基底細胞中,而BP患者皮損中CXCR5在水疤的疤頂及疤周圍表皮均有表達,且不只表達于基底細胞層,還表達于棘細胞層并達棘細胞中上部。CXCR5在BP患者皮損中陽性細胞表達均數較健康人皮膚明顯增加。因此,Tfh在BP的發病中可能起著重要的作用[14]。

綜上所述,我們推測,Tfh可能參與了BP的發生、發展過程。但由于樣本數量以及試驗方法單一,我們的研究也僅是對BP發病機制的初探,其具體作用機制以及與疾病嚴重程度、分型等相關研究還需進一步探索。

圖1 免疫組化檢測結果(×200) CXCR5陽性表達呈棕褐色顆粒,定位于胞質和包膜 1a:陰性對照;1b:健康人皮膚中CXCR5表達于基底細胞層;1c:大疤性類天疤瘡患者皮損中CXCR5表達于基底細胞層與棘細胞層,可達棘細胞層中上部;1d:疤頂及疤周皮膚均可見CXCR5的表達

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2013-06-26)

(本文編輯:顏艷)

Expression of CXC chemokine receptor 5 in skin lesions of bullous pemphigoid and its significance

Yang Min*,Zhu Yinghua,Cui Hongyan,Zhao Yan,Wang Huixiang.*Dalian Medical University,Dalian 116021,China

Zhu Yinghua,Email:zyh-office@163.com

ObjectiveTo study the role of CXC chemokine receptor 5(CXCR5)in the pathogenesis of bullous pemphigoid(BP)by detecting the expression of CXCR5 on follicular helper T(Tfh)cells in skin lesions of BP.MethodsAn immunohistochemical procedure was used to detect CXCR5 expression in biopsy specimens from skin lesions of 16 patients with BP and normal skin of 10 healthy individuals.ResultsCXCR5 was mainly expressed in the cytoplasm and membrane of Tfh cells in the basal cell layer of normal skin as well as in both basal cell layer and prickle cell layer of BP lesions.The number of CXCR5-positive cells per high power field(×400)was 11.16±4.47 in normal skin specimens,significantly lower than that in lesional skin specimens(35.70±12.20,t=6.07,P＜0.01).ConclusionCXCR5 may be involved in the pathogenesis of BP.

Pemphigoid,bullous;Receptors,chemokine;Follicular helper T lymphocytes

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.07.016

116021大連醫科大學(楊敏);大連市皮膚病醫院(朱英華、崔紅艷、趙巖、王繪翔)

朱英華,Email:zyh-office@163.com