苯胺及其部分衍生物對Bt亞種HD—1的毒理作用

劉建國+羅穩+朱桂梅+郝再彬+劉紅艷

摘要：以蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thutingiensis Berlinert）亞種HD-1菌株為指示菌，采用比濁法測定其生長曲線，研究苯胺、鄰氯苯胺、間氯苯胺、對氯苯胺對HD-1的生長抑制毒性，應用等比法分別測定每種化合物的劑量-效應數據，采用最小二乘擬合進行非線性擬合。結果表明，苯胺、鄰氯苯胺、間氯苯胺和對氯苯胺對標準菌HD-1的24 h EC50 分別為：0.034 901、0.004 967、0.004 797、0.004 686 mol/L，苯胺及苯胺衍生物對HD-1的毒性從小到大順序為苯胺、鄰氯苯胺、間氯苯胺、對氯苯胺。

關鍵詞：蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thutingiensis Berliner）;苯胺;衍生物;抑制率;劑量-效應曲線

中圖分類號：X171.5;Q938.1 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）20-4848-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.020

Toxicological Effects of Aniline and Some of Its Derivatives on Bacillus thuringiensis subsp. Kurstaki Strain HD-1

LIU Jian-guo， LUO Wen， ZHU Gui-mei， HAO Zai-bin， LIU Hong-yan

（Chemical and biological engineering college， Guilin university of technology， Guilin 541004， China）

Abstract：The growth curve of the indicator， Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki strain HD-1， and the growth inhibition effects of aniline and some of its derivatives on strain HD-1 were studied by turbidimetry. The dose-responses of each compound were determined by the ratio method. The least square method was used for nonlinear fitting. The results showed that the EC50 values of aniline， o-chloroaniline， m-chloroaniline and p-chloroaniline for strain HD-1 at 24 h were 0.034901， 0.004967， 0.004797 and 0.004686， respectively. For aniline and some of its derivatives， the toxicity to strain HD-1 was in the order of aniline < o-chloroaniline < m-chloroaniline < p-chloroaniline.

Key words：Bacillus thuringiensis; aniline and some of its derivatives; inhibition rate; DRC

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thutingiensis Berliner，簡稱Bt），是一種革蘭氏陽性土壤桿菌，屬于芽孢桿菌屬，其菌體為短桿狀，生鞭毛，單生或形成短鏈狀[1-3]。在生長代謝過程中會形成芽孢，在芽孢形成過程中產生δ-內毒素殺蟲伴胞晶體蛋白（ICP），ICP具有很高的殺蟲活性且對多種生物有毒力，敏感昆蟲一旦攝入，就可能致死[4，5]。由于這種殺蟲作用專一，對環境無害，對人畜安全，在許多國家和地區得到推廣，Bt制劑逐步發展成為世界上應用最廣泛的微生物殺蟲劑之一。目前，蘇云金桿菌制劑廣泛用于糧食作物、經濟作物與園藝作物害蟲、林業害蟲的防治[6-8]。蘇云金芽孢桿菌以原生態的生長環境中居多，環境中的有毒化合物對它生長的抑制作用研究鮮見報道。

環境細菌生長抑制試驗是毒理學生物測定的常用方法之一，與傳統生物毒性測定試驗方法相比，該方法費用低廉，占用空間相對較小，反應靈敏，可在相對較短的時間內評價化學品的毒性，提供有意義的毒性指標，預測化學物質進入環境可能引起的危害，適用于篩選和指示各種類型的環境毒物[9]。本研究采用現代毒理學中的生物方法[10]研究苯胺及氯苯胺對Bt亞種HD-1的毒性作用，為苯胺類環境污染物的環境毒性評估和風險評價提供理論依據。

1 ?材料和方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?菌種 ?標準Bt亞種菌株HD-1，中國農業科學院植物保護研究所提供。

1.1.2 ?試劑 ?苯胺（A1）、鄰氯苯胺（A2）、間氯苯胺（A3）、對氯苯胺（A4）均為化學純。

1.1.3 ?主要儀器設備 ?微電腦控制振蕩培養箱（廣東醫療器械廠，LRH-150-2Ⅱ型）;微電腦控制生化培養箱（廣東醫療器械廠，LRH-250-2Ⅱ型）;紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司，TU-1800S型）;移液槍（上海榮泰生化工程有限公司）。

1.1.4 ?培養基 ?種子培養基（1/2 LB固體培養基）：蛋白胨0.5%，酵母浸膏0.25%，氯化鈉0.5%，瓊脂粉1.5%，用氫氧化鈉調pH至7.0～7.4，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min[11]。

發酵培養基（LB培養基）：蛋白胨1.0%，酵母提取物0.5%，氯化鈉1.0%，用氫氧化鈉調pH至7.0～7.4，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 ?試驗方法

1.2.1 ?HD-1的活化 ?配制 1/2 LB固體培養基，倒入平板，平板冷卻凝結后，取出保存的HD-1菌株，用接種環挑取菌體在平板培養基上均勻劃線。將培養皿置于28 ℃生化培養箱中培養24 h，放入4 ℃冰箱保存，用于一級培養。

1.2.2 ?HD-1生長曲線的測定 ?配制LB培養基。將配制好的LB培養基分別量取120 mL于250 mL三角瓶中，平行2個樣，包扎好瓶口后進行121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。滅好菌后，挑取2環已活化24 h的HD-1菌體置于LB培養基中，30 ℃恒溫170 r/min振蕩培養。每4 h取樣1次，在波長600 nm下檢測OD 600 nm，培養至36 h，共取樣9次。

1.2.3 ?苯胺及其部分衍生物對Bt亞種HD-1的毒性作用 ?將HD-1 的一級培養菌液稀釋10倍，分別加到48個離心管中，每管稀釋菌液體積為1 mL。每個毒物設置12個梯度濃度，見表1。各管中LB培養基體積均為7 mL，以無菌水補足使每管體積為10 mL。其中，加毒物溶液組為試驗組，對應加等量無菌水的為空白對照組，1組空白對照，3組平行試驗組。24 h后檢測OD600 nm，每組平行測3次OD600 nm，計算抑制率。抑制率=（對照組OD600 nm -試驗組OD600 nm）/對照組OD600 nm×100%[12]。計算化合物對HD-1的抑制率。應用等比法分別測定每種化合物的劑量-效應數據，采用最小二乘擬合進行非線性擬合，應用Logistic 函數擬合各化合物對HD-1的毒性劑量-效應曲線。

2 ?結果與分析

2.1 ?BT亞種的生長曲線的繪制

以時間為橫坐標，OD600 nm為縱坐標，作圖得到HD-1的生長曲線。HD-1的生長曲線見圖1。

圖1表明，生長曲線出現了明顯的延緩期、對數期、穩定期和衰亡期。12～24 h是對數生長期，此時期的菌液適于做種子;在24 h這一時間點處菌體濃度最大，表明這一時間點最適合檢測菌體發酵液的OD600 nm。

2.2 ?苯胺及其部分衍生物對Bt亞種HD-1的單一毒性作用

計算得到苯胺、鄰氯苯胺、間氯苯胺和對氯苯胺分別對HD-1的毒性劑量-效應曲線分別見圖2、3、4、5。對苯胺對HD-1毒性劑量-效應曲線進行擬合，DRC模型呈S形，是按半數效應對稱的，計算得到苯胺的EC50=0.034 901 mol/L;擬合鄰氯苯胺對HD-1毒性劑量-效應曲線，DRC模型也呈S形，低濃度毒物對HD-1菌的抑制作用不穩定，偶爾會出現刺激生長情況，鄰氯苯胺的EC50=0.004 967 mol/L;擬合間氯苯胺對HD-1毒性劑量- 效應曲線，DRC模型呈S形。低濃度梯度毒物對HD-1菌的抑制作用不穩定，偶爾會出現刺激菌體生長情況，偏差較大，而且試驗重現性差，計算得到間氯苯胺的EC50=0.004 797 mol/L;擬合對氯苯胺對HD-1毒性劑量- 效應曲線，DRC模型同樣呈S形，計算得到對氯苯胺的EC50=0.004 686 mol/L。

3 ?結論

1）HD-1生長曲線出現了明顯的延緩期、對數期、穩定期和衰亡期，12～24 h是對數生長期，此時期的菌液適于做種子;在24 h這一時間點處菌體濃度最大，表明這一時間點最適合檢測該菌發酵液的OD600 nm。

2）在24 h時，苯胺、鄰氯苯胺和間氯苯胺各濃度梯度對HD-1均有毒性作用，且相對穩定，高濃度梯度對菌體的抑制作用明顯。對氯苯胺較高濃度（0.005 877 mol/L）對HD-1的抑制作用明顯，但到0.001 926 mol/L開始出現刺激菌體生長現象，且低濃度梯度的菌體生長不穩定。苯胺及氯苯胺對HD-1的毒性劑量-效應模型均呈S形，苯胺的EC50=0.034 901 mol/L，鄰氯苯胺的EC50=0.004 967 mol/L，間氯苯胺的EC50=0.004 797 mol/L，對氯苯胺的EC50=0.004 686 mol/L。這4種化合物的實測毒性與模型估算效應之間的相關系數都達0.95以上。比較苯胺及氯苯胺對HD-1毒性半數效應濃度的大小可知，這4種苯胺類化合物的毒性從小到大依次為苯胺、鄰氯苯胺、間氯苯胺、對氯苯胺。

參考文獻：

[1] 喻子牛.蘇云金桿菌[M].北京：科學出版社，1990.

[2] SEMIH Y， ABDURRAHMAN A， Mikail A， et al. A novel Bacillus thuringiensis strain and its pathogenicity against three important pest insects[J]. Journal of Stored Products Research， 2012， 51： 33-40.

[3] BAI C. Control of Spodoptera exempta （Walker） with Bacillus thuringiensis Berliner and benzoylphenylureas[D]. Belgium：University of Ghent， 1992.

[4] JAE Y C， JUNG M P， PARK H H， et al. Insecticidal activity of recombinant baculovirus co-expressing Bacillus thuringiensis crystal protein and Kunitz-type toxin isolated from the venom of bumblebee Bombus ignitus[J]. Journal of Asia-Pacific Entomology， 2013， 16： 75-80.

[5] DALEL B T， MARWA S， LOBNA A M， et al. Histopathological effects and determination of the putative receptor of Bacillus thuringiensis Cry1Da toxin in Spodoptera littoralis midgut[J]. Journal of Invertebrate Pathology， 2013， 112： 142-145.

[6] 翟興禮，陳慶華.蘇云金芽孢桿菌兩個亞種對幾種常見抗菌藥物的敏感性試驗[J].江蘇農業科學，2009（1）：120-121.

[7] VAN FRANKENHUYZEN K. Insecticidal activity of Bacillus thuringiensis crystal proteins[J].Journal of Invertebrate Pathology， 2009， 101： 1-16.

[8] BAI C. An overview on the crystal and genetic engineering of the toxin protein gene of Bacillus thuringiensis[J]. Sinozoologia， 1990， 7： 333-338.

[9] BOTSOFORD J L， RIVERA J. Assay for toxic chemical using bacteria[J]. Bull Environ Contam Toxicol， 1997， 59（6）： 1000-1009.

[10] 付立杰.現代毒理學及其應用[M].上海：上海科學技術出版社， 2001.

[11] 常亞飛，陳守文，喻子牛.蘇云金素發酵培養基的優化設計[J].中國生物防治，2006，22（3）：190-194.

[12] 黃文風.酶催化動力學光度法快速測定蔬菜中農藥殘留[J].現代科學儀器，2000（2）：96-99.

[4] JAE Y C， JUNG M P， PARK H H， et al. Insecticidal activity of recombinant baculovirus co-expressing Bacillus thuringiensis crystal protein and Kunitz-type toxin isolated from the venom of bumblebee Bombus ignitus[J]. Journal of Asia-Pacific Entomology， 2013， 16： 75-80.

[5] DALEL B T， MARWA S， LOBNA A M， et al. Histopathological effects and determination of the putative receptor of Bacillus thuringiensis Cry1Da toxin in Spodoptera littoralis midgut[J]. Journal of Invertebrate Pathology， 2013， 112： 142-145.

[6] 翟興禮，陳慶華.蘇云金芽孢桿菌兩個亞種對幾種常見抗菌藥物的敏感性試驗[J].江蘇農業科學，2009（1）：120-121.

[7] VAN FRANKENHUYZEN K. Insecticidal activity of Bacillus thuringiensis crystal proteins[J].Journal of Invertebrate Pathology， 2009， 101： 1-16.

[8] BAI C. An overview on the crystal and genetic engineering of the toxin protein gene of Bacillus thuringiensis[J]. Sinozoologia， 1990， 7： 333-338.

[9] BOTSOFORD J L， RIVERA J. Assay for toxic chemical using bacteria[J]. Bull Environ Contam Toxicol， 1997， 59（6）： 1000-1009.

[10] 付立杰.現代毒理學及其應用[M].上海：上海科學技術出版社， 2001.

[11] 常亞飛，陳守文，喻子牛.蘇云金素發酵培養基的優化設計[J].中國生物防治，2006，22（3）：190-194.

[12] 黃文風.酶催化動力學光度法快速測定蔬菜中農藥殘留[J].現代科學儀器，2000（2）：96-99.

[4] JAE Y C， JUNG M P， PARK H H， et al. Insecticidal activity of recombinant baculovirus co-expressing Bacillus thuringiensis crystal protein and Kunitz-type toxin isolated from the venom of bumblebee Bombus ignitus[J]. Journal of Asia-Pacific Entomology， 2013， 16： 75-80.

[5] DALEL B T， MARWA S， LOBNA A M， et al. Histopathological effects and determination of the putative receptor of Bacillus thuringiensis Cry1Da toxin in Spodoptera littoralis midgut[J]. Journal of Invertebrate Pathology， 2013， 112： 142-145.

[6] 翟興禮，陳慶華.蘇云金芽孢桿菌兩個亞種對幾種常見抗菌藥物的敏感性試驗[J].江蘇農業科學，2009（1）：120-121.

[7] VAN FRANKENHUYZEN K. Insecticidal activity of Bacillus thuringiensis crystal proteins[J].Journal of Invertebrate Pathology， 2009， 101： 1-16.

[8] BAI C. An overview on the crystal and genetic engineering of the toxin protein gene of Bacillus thuringiensis[J]. Sinozoologia， 1990， 7： 333-338.

[9] BOTSOFORD J L， RIVERA J. Assay for toxic chemical using bacteria[J]. Bull Environ Contam Toxicol， 1997， 59（6）： 1000-1009.

[10] 付立杰.現代毒理學及其應用[M].上海：上海科學技術出版社， 2001.

[11] 常亞飛，陳守文，喻子牛.蘇云金素發酵培養基的優化設計[J].中國生物防治，2006，22（3）：190-194.

[12] 黃文風.酶催化動力學光度法快速測定蔬菜中農藥殘留[J].現代科學儀器，2000（2）：96-99.