川貝母多倍體誘導條件的優化及含量測定

江明殊+王躍華+劉濤+范文萍+楊敏+王曉蓉

摘要：采用正交試驗法考察秋水仙素濃度、浸泡時間、二甲基亞砜體積分數、處理溫度對川貝母（Fritillaria cirrhosa）愈傷組織多倍體誘導的影響。以多倍體誘導率為指標，用正交試驗表L9（34）進行試驗，篩選最佳誘導條件。在考察的因素中，對川貝母多倍體誘導率影響的大小次序依次為秋水仙素濃度>浸泡時間>二甲基亞砜體積分數>處理溫度。多倍體誘導條件的最優組合是秋水仙素濃度為900 mg/L、浸泡時間為48h、二甲基亞砜體積分數為4%、處理溫度為20 ℃，在此條件下，其誘導率可達94.3%;細胞染色體鑒定結果為四倍體染色體數為2n=4x=48，誘導后的愈傷組織為多倍體;對野生、組培二倍體、組培多倍體川貝母鱗莖進行有效藥用成分生物堿總含量測定，其中組培多倍體生物堿總含量最高為0.657%。

關鍵詞：川貝母（Fritillaria cirrhosa）;愈傷組織;多倍體;生物堿;正交試驗

中圖分類號：Q813.1+2 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）20-4903-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.034

Optimizing the Conditions of Inducing Polyploid of Fritillaria cirrhosa

and Content Determination

JIANG Ming-shu1，2，WANG Yue-hua2，LIU Tao2，FAN Wen-ping2，YANG Min2，WANG Xiao-rong3

（1. Life Science College，Sichuan Normal University，Chengdu 610101， China;2. Chengdu Faculty of Biotechnology Institute，Chengdu University，Chengdu 610106， China;3. Enwei Investment（Group） Ltd. Corporation，Chengdu 610200， China）

Abstract：The induction rate of optimized conditions of Fritillaria cirrhosa including the concentration of colchcine，the time of being soaked in colchcine，the volume fraction of dimethyl sulfoxide and temperature was determined by orthogonal text. A optimal combination was screened through the crossed test of L9（34）. The order of factors ?affecting the induction rate was the concentration of colchcine> the time of being soaked in colchcine> the volume fraction of dimethyl sulfoxide> temperature. The optimal combination was the concentration of colchcine 900 mg/L，the time of being soaked in colchcine 48 h，the volume fraction of dimethyl sulfoxide 4%，temperature ?20 ℃， with induction rate of 94.3%. Compared with the chromosomal number，it was proved that the callus of F. cirrhosa was polyploidy. The contents of total bio-medicinal ingredients with wild，tissue culture of diploid and polyploid bulbs of F. cirrhosa were effectively determinated. The total alkaloid content of polyploid bulbs of F. cirrhosa was the highest with up to 0.657%.

Key words：Fritillaria cirrhosa ;callus;polyploidy;alkaloid;orthogonal test

川貝母（Fritillaria cirrhosa）為名貴川產道地藥材，主要用于治療肺熱燥咳、痰多胸悶等癥，主要分布于我國西南部橫斷山區海拔2 800～4 700 m的高山灌叢或草地中。

目前川貝母藥用資源短缺，但有報道稱藥用植物多倍體可大幅度提高藥材的產量[1-3]。多倍體植物往往具有器官巨大的特點，并且由于細胞染色體加倍，染色體上基因調控產生的有效化學成分含量也往往較正常二倍體高。因此通過組織培養與多倍體誘導相結合的方式生產其藥用活性成分總生物堿，以緩解需求與藥材供給、資源枯竭之間的矛盾。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

二倍體組培愈傷組織來自成都大學組培室，市售川貝母鱗莖購于成都市同仁堂藥店。

1.2 ?儀器與試劑

超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司;紫外分光光度計，上海實驗儀器廠有限公司;電子天平，北京賽多利斯天平有限公司;立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠;多段可編程光照培養箱，寧波東南儀器有限公司;數顯恒溫水浴鍋，常州澳華儀器有限公司;西貝母堿：中國食品藥品檢定研究院，批號20110706;乙醇（95%）：分析純AR，成都市科龍化工試劑廠，批號20110823;甲醇：分析純AR，成都市科龍化工試劑廠，批號20100213;三氯甲烷：分析純AR，成都市科龍化工試劑廠，批號20110524;濃氨水：分析純AR，成都市科龍化工試劑廠，批號20120220;溴甲酚綠：成都市科龍化工試劑廠，批號20101028;磷酸二氫鉀：分析純AR，成都市科龍化工試劑廠，批號20121117;氫氧化鈉：分析純AR，成都市科龍化工試劑廠，批號20090228;水為去離子水。

1.3 ?方法

1.3.1 ?正交試驗因素與水平 ?王強等[4]、 王躍華

等[5]采用單因素試驗考察了秋水仙素濃度、浸泡時間對川貝母愈傷組織多倍體誘導的影響，但是影響多倍體誘導的因素很多，而單因素試驗不能綜合考慮各個因素的影響，因此本試驗采用正交試驗法。試驗選擇了秋水仙素濃度、二甲基亞砜體積分數、浸泡時間、處理溫度4個因素，每個因素取3個水平，采用正交試驗L9（34）進行試驗（表1）。

1.3.2 ?愈傷組織的誘導 ?在超凈工作臺上，將川貝母無菌鱗莖切成0.8 cm見方的小塊，接種到愈傷組織誘導培養基MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.3 mg/L+蔗糖30 g/L中，每天光照12 h，光照強度為1 200 lx，培養溫度為21 ℃，30 d繼代培養一次。

1.3.3 ?多倍體的誘導 ?按照表2的設計，進行9組試驗。在超凈工作臺上，將川貝母愈傷組織切成0.8 cm見方的小塊， 放入含不同濃度（600～1 200 mg/L）秋水仙素和添加了二甲基亞砜的混合溶液中，浸泡時間為24～48 h，處理溫度為15～25 ℃。每組試驗浸泡30塊川貝母愈傷組織。

1.3.4 ?多倍體的培養 ?按照正交設計作不同的處理，處理結束后用無菌去離子水沖洗3次，轉接入不含秋水仙素的增殖培養基MS+2，4-D 0.6 mg/L+KT 1.0 mg/L+蔗糖30 g/L中讓其恢復生長，每組接15瓶， 每瓶2塊。 先暗培養5 d， ?之后再進行光照培養， 每天光照12 h， 光照強度為1 200 lx， 溫度為21 ℃。

1.3.5 ?多倍體的鑒定 ?取誘導后的川貝母愈傷組織適量于2 g/L秋水仙素溶液中預處理2.5 h左右，水洗后用甲醇-冰醋酸（體積比3∶1）固定液固定4 h，再用混合酶（纖維素酶和果膠酶各占25 g/L）在25 ℃恒溫箱內處理3 h，倒去酶液，用去離子水洗3次，每次2 min，除去去離子水后制備細胞懸液，用懸滴法[6]制片，干燥后，用Giemsa染色后觀察。

1.3.6 ?總生物堿含量的測定 ?參照參考文獻[7]里川貝母項下方法，取西貝母堿5 mg，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，加入三氯甲烷至刻度，搖勻，備用。精密量取對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、1.0 mL置于25 mL具塞試管中，分別補加三氯甲烷至10.0 mL，精密加水5 mL，再精密加0.5 g/L溴甲酚綠緩沖液2 mL，密塞，劇烈振搖，轉移到分液漏斗中，放置30 min，取三氯甲烷液，用干燥濾紙濾過，取續濾液，以相應的試劑為空白對照，參照紫外-可見分光光度法在415 nm的波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，西貝母堿濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

本試驗采用紫外分光光度法測定其總生物堿含量。精密稱取烘干至恒重的野生川貝母鱗莖、二倍體組培愈傷組織、多倍體愈傷組織樣品各2.0 g，置于具塞錐形瓶中，加濃氨水3 mL，浸潤1 h，加三氯甲烷-甲醇（體積比4∶1）混合液40 mL，置于80 ℃水浴加熱回流2 h，放冷過濾，濾液置于50 mL量瓶中，用適量三氯甲烷-甲醇（體積比4∶1）混合液洗滌藥渣2～3次，洗液并入同一量瓶中，加三氯甲烷-甲醇（體積比4∶1）混合液至刻度，搖勻。精密量取2～5 mL，置于25 mL具塞試管中，水浴蒸干，精密加入三氯甲烷10 mL使其溶解，精密加水5 mL，再精密加0.5 g/L溴甲酚綠緩沖液2 mL，密塞，劇烈振搖，轉移到分液漏斗中，放置30 min，取三氯甲烷液，用干燥濾紙過濾，取續濾液，待用。以相應的試劑為空白對照，參照紫外-可見分光光度法，在415 nm的波長處測定吸光度，用回歸方程[8]計算其總生物堿的含量。總生物堿含量=（A+0.012）×n/（W×106×0.010 8）×100%，式中，A——吸光度;n——稀釋倍數;W——試樣質量。

2 ?結果與分析

2.1 ?愈傷組織的獲得

將川貝母無菌鱗莖小塊置于愈傷組織誘導培養基MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.3 mg/L+蔗糖30 g/L中培養20 d左右，鱗莖切口處出現淡綠色愈傷組織，隨著培養時間的延長，愈傷組織的顏色逐漸加深，繼續繼代培養30 d，即可獲得大量的川貝母愈傷組織。

2.2 ?正交試驗結果

2.2.1 ?直觀分析結果 ?根據正交試驗L9（34）進行試驗，30 d左右對其進行數據統計。以多倍體誘導率為評價指標，然后對試驗結果進行極差和方差分析，并確定其最優組合。

為了直觀起見，以因素為橫坐標，誘導率為縱坐標，作效應曲線（圖1）。由表2可知，各因素對多倍體誘導率的影響次序為：秋水仙素濃度>浸泡時間>二甲基亞砜體積分數>處理溫度， 秋水仙素濃度為主要因素，處理溫度為次要因素， 最優組合是A2B3C3D3，即秋水仙素濃度為900 mg/L， 浸泡時間為48 h，添加的二甲基亞砜體積分數為4%， 處理溫度為25 ℃。由圖1可知，秋水仙素濃度在600～900 mg/L范圍內， 多倍體誘導率隨著秋水仙素濃度的增加而升高。這與王強等[4]在秋水仙素誘導川貝母愈傷組織多倍體研究中的結論相符。秋水仙素濃度在900～1 200 mg/L范圍內， 多倍體誘導率隨著秋水仙素濃度的增加反而有所降低， 因為高濃度的秋水仙素對細胞的傷害作用增大， 愈傷組織的受害率增加，進而影響其誘導率。

2.2.2 ?方差分析結果 ?直觀分析法不能估計試驗誤差大小，也不知道分析的精度[9]，因此需采用方差分析法進行統計學檢驗。

由方差分析可知，本試驗中的秋水仙素濃度、浸泡時間、二甲基亞砜體積分數都對多倍體的誘導率影響顯著，而處理溫度對多倍體的誘導率影響不顯著。根據直觀分析結果，綜合考慮確定川貝母的最適培養溫度為20～21 ℃，其最優組合為A2B3C3D2，即秋水仙素濃度為900 mg/L，浸泡時間為48 h，添加的二甲基亞砜體積分數為4%，處理溫度為20 ℃。

2.2.3 ?驗證試驗結果 ?由于本試驗的最優組合未在試驗組中出現，因此需進行驗證試驗。按照最佳工藝條件A2B3C3D2對川貝母愈傷組織進行多倍體誘導，結果多倍體誘導率為94.3%，誘導率較高，優選的工藝條件穩定可行，重現性好。因此本試驗的最優組合為A2B3C3D2，即秋水仙素濃度為900 mg/L，浸泡時間為48 h，二甲基亞砜體積分數為4%，處理溫度為20 ℃。

2.3 ?多倍體鑒定結果

取誘導后的川貝母愈傷組織進行染色體數目檢測，并進行顯微拍照，結果見圖2和圖3。對照組的染色體數2n=24，誘導組的染色體數2n=48，由此可以確定誘導后的川貝母愈傷組織為多倍體。

2.4 ?含量測定結果

按照參考文獻[7]川貝母項下進行，在415 nm處測吸光度，以吸光度為縱坐標、取樣量為橫坐標，繪制標準曲線，計算得回歸方程為Y=10.663X-0.001 0，r=0.999 8，結果顯示取樣量在0.004 88～0.035 04 mg有良好的線性關系。

測定各樣品的吸光度并計算其生物堿總含量（表3）。試驗結果顯示野生川貝母鱗莖生物堿總含量為0.237%，組培二倍體愈傷組織生物堿總含量為0.249%，經最佳處理培育的組培多倍體愈傷組織生物堿總含量為0.657%。

2.5 ?生物堿總含量的比較結果

由表4可知，組培多倍體愈傷組織生物堿總含量較組培二倍體愈傷組織、野生川貝母鱗莖均高，幾乎是后二者的3倍。分析原因可能是組培多倍化后的川貝母隨著其染色體加倍，細胞內有效成分也隨著加倍。且經組培的川貝母在人為管理下，其生長環境更有利于細胞內有效成分的積累，所以結果中顯示出組培二倍體愈傷組織生物堿總含量大于野生川貝母鱗莖。因此，采用多倍體誘導技術可以快速使有效成分生物堿的含量增加。這不僅可以改善長期以來采挖野生川貝母為藥用資源的現狀，而且對野生川貝母資源的保護起到了積極作用。

3 ?討論

近年來在許多藥用植物誘導獲得多倍體的研究中，多采用秋水仙素對試驗材料進行處理，誘導率普遍為30%左右[10]。本試驗通過正交設計，考察了包括秋水仙素濃度、浸泡時間、二甲基亞砜體積分數、處理溫度對川貝母愈傷組織多倍體誘導率的影響。結果表明，當秋水仙素濃度為900 mg/L、浸泡時間為48 h、二甲基亞砜體積分數為4%、處理溫度為20 ℃時，多倍體誘導率最佳。

試驗表明，當二甲基亞砜體積分數為0～4%時，多倍體的誘導率一直增高，而且與相關研究的多倍體誘導率比較，本試驗川貝母多倍體誘導率有所提高。如王強等[4]在秋水仙素誘導川貝母愈傷組織多倍體的研究中，誘導率最高為70%，而本試驗誘導率高達94.3%。分析其原因為二甲基亞砜是一種滲透劑，它能提高細胞壁的透性[11]，從而有利于秋水仙素進入植物細胞，這就增大了秋水仙素分子與微管蛋白二聚體結合的機會，從而使微管蛋白的形成受阻，進而抑制或妨礙細胞的紡錘絲形成，使分裂的染色體停留在赤道板，不向兩級移動，導致染色體數目增加。由此可見，本試驗濃度范圍內的二甲基亞砜對川貝母愈傷組織多倍體的誘導率具有增效作用。

為確定多倍化川貝母對生物堿含量的影響，本試驗將經多倍化誘導的川貝母與組培二倍體愈傷組織以及野生川貝母鱗莖進行了生物堿總含量測定。結果表明，組培多倍化后的川貝母生物堿總含量最高。目前，已知生物堿是貝母屬植物的藥用有效成分，甾類生物堿又是其主要類型[12]。大多數的植物通過甲戊羥酸途徑合成甾類化合物，川貝母甾類生物堿的合成也被認為是主要通過此途徑完成[13，14]。在合成的途徑中，3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）是一種比較重要的酶。隨著對HMGR研究的深入，越來越多的研究結果表明，一些生物或非生物刺激可以調節HMGR的轉錄或表達水平，從而對下游甾類化合物的生物合成進行人為調控[15，16]。本試驗所采用的4種因素對川貝母進行的多倍體誘導是否間接影響了生物堿的合成還有待進一步研究。

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