犬乳腺癌預后分子標記的篩選

葉云+鐘英英+張倩

摘要：為了獲得犬乳腺癌轉移早期的分子標記，比較了27個淋巴結轉移/不轉移犬乳腺癌樣本的基因芯片數據，獲得了775個差異表達基因，并用Cox比例風險模型進行基因表達的單因素分析得到38個與生存顯著相關的基因。在此基礎上用懲罰Cox模型對樣本進行生存預測，得到10個基因的分類器，可以比較準確預測樣本的預后風險，準確率可達到92.3%。這些基因與雌激素代謝、細胞分化、轉錄等生物學過程相關，可能為犬乳腺癌預后分子標記和治療靶標，這將給犬乳腺癌的臨床診斷和治療提供新的思路。

關鍵詞：淋巴結轉移;犬乳腺癌;預后標記;基因芯片

中圖分類號：S829.2 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）20-4912-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.036

Screening Prognosis Markers for Canine Mammary Tumor

YE Yun，ZHONG Ying-ying，ZHANG Qian

（College of biological and chemical engineering， Guangxi university of science and technology， Liuzhou 545006， Guangxi，China）

Abstract： As one of the most important prognostic factors in the diagnosis of canine mammary tumor， lymph node metastasis was an early step in metastasis. In order to find out the markers in early stage， 27 microarray data of lymph node metastasis positive or negative samples of canine mammary carcinomas were analyzed. 775 significantly differentially expressed genes were obtained. The univariate analysis using Cox proportional hazards model showed that 38 genes were significantly related with survival. 10-gene classifier obtained by penalized Cox proportional hazards model was used to predict the risk of canine mammary tumor samples. The accuracy was 92.3%. These genes were associated with the pathways of estrogen metabolism， cell differentiation， transcription and so on， and might be prognostic molecular markers and potential therapeutic targets. It will provide a new way for the diagnosis and therapy of canine mammary tumor.

Key words： lymph node metastasis; canine mammary tumor; prognosis marker; microarray

乳腺腫瘤是母犬最常見的腫瘤。在犬乳腺癌中，淋巴結轉移是臨床診斷的重要指標，也是發生遠處轉移的早期事件，伴隨著遠處轉移的發生，往往會導致犬類的死亡[1]。早期檢測是有效治療乳腺癌并延長動物生存時間的有效途徑，而淋巴結轉移發生的分子機制仍然不夠清楚，傳統的病理檢驗也難以找到更好的檢測指標。因此，很有必要開發新的生物標記來檢測早期的犬乳腺癌。乳腺癌轉移是多基因參與和調控的過程，利用基因芯片技術可以從全基因組水平了解淋巴結轉移所發生的基因表達變化，從而篩選出與預后有關的分子標記，為犬乳腺癌的診斷和治療提供更好的理論依據。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗材料

本研究采用的基因芯片數據來自美國國立生物技術信息中心（NCBI）的公共數據庫GEO（Gene expression omnibus），編號為GSE20718，為Affymetrix 公司的Canine Genome 2.0 Array平臺的芯片，共包含13個淋巴結轉移的犬乳腺癌和14個不轉移的犬乳腺癌樣本，生存時間大于24個月的樣本有13個，小于24個月的有12個，最短生存時間為1個月，有2個樣本生存時間缺失。

1.2 ?淋巴結轉移相關差異基因的篩選

芯片數據的統計學分析采用BRB-ArrayTools（Version4.2.1）軟件包來進行，首先采用倍值過濾和表達水平過濾等方法對數據進行篩選：去除兩類樣本的基因中位數值小于2倍、表達值小于100的數據，以獲得質量可靠的信號點，合并相同基因的探針。將通過過濾標準的基因進行兩樣本非配對樣本t檢驗（P<0.001，FDR<0.01），篩選淋巴結轉移與原位腫瘤之間的差異表達基因。

1.3 ?生存分析及預測

將篩選得到的淋巴結轉移相關的差異基因作為候選基因，以術后生存時間作為生存時間變量，是否死亡作為生存狀態，采用Cox比例風險模型和Wald Statistic，在BRB-ArrayTools中對基因表達進行單因素分析，進一步篩選出與生存顯著相關的基因（P<0.001），用Kaplan-Meler法作圖分析這些基因表達對術后生存的影響。在此基礎上，將樣本分成兩組，其中一組為訓練組（Training，n=12），另外一組作為驗證組（Test，n=13），用懲罰Cox模型對樣本進行生存預測。100次隨機對數秩檢驗（Log-rank test），采用留一法（Leave-one-out）進行驗證，獲得小于10個基因的分類器用于預測樣本的預后，將樣本分為低風險和高風險兩組。由于病例樣本中有兩例生存時間缺失，因此只有25例樣本用于生存分析。另外，生存時間大于24個月的樣本在分析中定為24個月。

1.4 ?基因功能注釋

通過在線分析工具對生存分析相關的基因進行基因本體（Gene ontology，GO，www.geneontology.org）注釋，并通過文獻挖掘，找到這些基因相應的生物學功能及其對應的生物學通路，從而探討這些基因對犬乳腺癌預后可能存在的影響機制。

2 ?結果與分析

2.1 ?淋巴結轉移相關基因的獲得

通過初步數據過濾，共有3 507個基因符合過濾標準。然后，對13個淋巴結轉移的犬乳腺癌和14個不轉移的犬乳腺癌樣本進行隨機方差模型的兩樣本t檢驗，轉移/不轉移的兩組樣本間表達倍數大于2的探針為差異表達基因，按此標準獲得了775個差異表達基因，其中上調基因496個，下調基因201個。

2.2 ?生存相關基因的獲得

合并共同基因的探針，將上述獲得的淋巴結轉移差異基因用于生存分析。由于只將樣本分為兩個樣本組，因此，在Cox比例風險模型用24個月作為分界點。基因表達的單因素分析得到38個與術后生存顯著相關的基因（P<0.001），其中10個基因在預后好的樣本中高表達，28個基因在預后差的樣本中高表達。

2.3 ?生存預測及相關基因功能注釋

經過100次隨機Log-rank test，留一法進行交叉檢驗，從生存相關的基因中篩選到10個基因的分類器，Kaplan-Meler生存曲線表明，分類器可以將樣本分為高風險和低風險兩個組（P<0.05，圖1）。由于在分析中只分兩個風險組，因此，構建風險分組的預后指數百分數為50，樣本的預后指數大于1即為高風險，反之小于1則為低風險。

對Test組的生存預測結果如表1所示，13個樣本中低風險樣本有7個，另外的6個樣本則被預測為高風險。低風險樣本的實際術后生存時間均超過24個月，而高風險樣本中除了GSM520212的實際術后生存時間超過24個月之外，其他5個樣本的術后生存時間均不到10個月，預測準確率達到92.3%。如表2所示，經過基因本體分析（GO），分類器的10個基因中，只有LOC611412功能未知。其余的9個基因中，SULT1E1與雌激素活化有關，FST參與細胞分化和卵泡刺激素的負調控等生物學過程，GTF2A2和MITF都與轉錄調控相關，ETFDH和LOC475273則與氧化應激、電子傳遞等生物學功能有關。

3 ?討論

淋巴結轉移與犬乳腺癌的預后關系密切，本研究用生物信息學的手段從淋巴結轉移的差異基因中篩選出38個與犬乳腺癌生存顯著相關的基因，由此篩選出的10個基因分子分類器能比較準確預測犬乳腺癌病例的預后風險，準確率達到92.3%。這些基因與細胞分化、雌激素代謝及轉錄等生物學過程相關，可作為犬乳腺癌預后分子標記的候選基因。其中，SULT1E1為硫酸基轉移酶（Sulfotransferases，SULTs）SULT1家族的主要成員之一，是目前所發現的13種同功酶中對雌激素催化作用最強的酶[2]。有研究指出SULT1E1基因表達下調可導致雌激素依賴性腫瘤的發生、發展，可作為獨立的判斷乳腺癌預后的指標[3]。本研究通過基因表達的單因素生存分析結果也表明，SULT1E1基因在預后差的樣本（n=12）中低表達，而在生存期大于24個月的樣本中均高表達（n=13）。作為重要的解毒酶類，SULT1E1可以將PAPS的硫酸根轉移至雌激素的3-羥基上，形成水溶型無活性硫酸化雌激素，從而降低循環及靶組織中雌激素暴露水平[4]。乳腺癌是雌激素依賴性腫瘤，SULT1E1基因低表達會使雌激素活性增加，從而增加乳腺組織暴露于雌激素的機會增加。FST是編碼的蛋白是一種單鏈糖蛋白，在腦、乳腺、腎臟等組織中均有表達，在卵巢組織中濃度最高[5]。FST的高表達有利于卵巢癌的治療。FST的表達受到一個BRCA1基因的調控，高水平的BRCA1可提高FST的表達[6]。BRCA1被認為是一種乳腺癌的抑癌基因，編碼一種DNA結合蛋白，在正常乳腺上皮細胞的轉錄中起重要調控作用，抑制細胞進入增殖周期[7]。基因表達譜分析表明，FST在預后好的犬乳腺癌樣本（n=13）中高表達，這表明可能在預后好的樣本中BRCA1存在一定的表達量。由于BRCAl蛋白表達缺失與乳腺癌惡性程度、預后差有一定關系[8]，因而BRCA1的表達有利于乳腺癌的預后。

腫瘤的發生發展是多個基因共同作用的過程，高通量的基因表達譜分析可以從全基因組水平較為全面了解腫瘤發生的機制。利用高通量方法篩選犬乳腺癌的預后分子標記，可為動物乳腺癌乃至人乳腺癌的臨床診斷和治療提供了更加豐富的研究手段。

參考文獻：

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