產D—乳酸菊糖芽孢乳桿菌的誘變及發酵條件研究

劉聯杰，周安盛，方聰明，王常高+林建國+杜馨+蔡俊

摘要：以菊糖芽孢乳桿菌（Sporolactobacillus inulinus）為出發菌株，經紫外線、硫酸二乙酯的誘變處理，采用碳酸鈣平板初篩及搖瓶復篩得到1株高產D-乳酸的正向突變株D11。通過單因素試驗研究D11菌株發酵產D-乳酸的條件。結果表明，當發酵溫度37 ℃，初始pH 6.5，轉速160 r/min，接種量5%，裝液量50 mL/250 mL，發酵68 h，該菌株D-乳酸產量達到56.18 g/L，比出發菌種提高49.53%。

關鍵詞： 菊糖芽孢乳桿菌（Sporolactobacillus inulinus）;D-乳酸;誘變育種;正向突變

中圖分類號：Q935 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）20-4936-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.043

Mutation Breeding and Optimization of Fermentation for Producing D-lactic Acid

with Sporolactobacillus inulinus

LIU Lian-jie， ZHOU An-sheng， FANG Cong-ming， WANG Chang-gao， LIN Jian-guo， DU Xin， CAI Jun

（Key Laboratory of Fermentation Engineering of Ministry of Education/Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation， Hubei University of Technology， Wuhan 430068， China）

Abstract： After the original strain Sporolactiobacillus inulinus was mutated by UV and DES and selected by CaCO3 plates， a D-lactic acid yield positive mutant D11 by fermenting in shake flask was obtained. Through the single factor experiment， the fermentation conditions of producing D-lactic acid was studied. The results showed that the D-lactic acid production reached 56.18g/L when the fermentation temperature was 37 ℃，initial pH was 6.5， the rotation speed was 160 rpm/min， inoculums was 5%（V/V）， liquid volume was 50 mL/250 mL， fermentation time 68 h. The D-lactic acid production reached 56.18 g/L and was enhanced by 49.53% compared with original strain.

Key words： Sporolactobacillus inulinus; D-lactic acid; mutation breeding; forward mutation

乳酸是自然界最小的手性分子，具有L（+）和D（-）兩種光學構型。D-乳酸作為一個手性中心，是合成多種手性物質的前體，在醫藥、農藥、化工等方面的應用十分廣泛。與L-乳酸繁榮的研究景象相比，D-乳酸的開發略顯單薄[1]。異構體之一的D-乳酸是一種重要的手性中間體和生物可降解聚乳酸材料合成的原料。近年來石油資源的日益減少以及人們環保意識的提高，極大地促進了通過發酵法合成D-乳酸的需求量，同時要求對其生產菌種的發酵性能進行改造。研究者們利用誘變育種策略顯著提高了乳酸菌的D-乳酸產量[2]。

微生物誘變育種技術可選育出產量高、性狀優良的突變株。通過發酵條件優化可確定微生物高效合成產物的最適環境[3]。目前，通過誘變選育獲得高產D-乳酸的工作已有一些報道，如：用甲基磺酸乙酯（EMS）對野生型Lactobacillus delbrueckii ATCC 9649 菌株進行誘變，突變菌株DP3利用復雜培養基乳酸產量可達117 g/L，比出發菌種提高了75%，且具有更高的乳酸耐受能力、生長速率和轉化率[4，5]。用氮離子束對芽孢乳桿菌（Sporolactobacillus）進行誘變，突變菌株Y2-8的D-乳酸產量達122 g/L，比出發菌株提高了2倍。于培星[6]以凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）JD-063D為出發菌株，采用紫外線、硫酸二乙酯、鈷60γ-射線輻照、微波進行復合誘變，得到正突變菌株，進行發酵檢測和遺傳穩定性試驗，最終篩選出一株JD-76D，該菌株產酸由出發茵株的61 g/L提高到145 g/L，D-乳酸純度由原菌株的97.5%增加到98.7%以上。

本試驗以紫外線和硫酸二乙酯誘變處理的方法，對菊糖芽孢乳桿菌（Sporolactobacillus inulinus）的選育及誘變后的最適發酵條件（發酵時間、發酵溫度、初始pH、搖床轉速、接種量、裝液量等）進行了研究。

1 ?材料與方法

1.1 ?菌種

菊糖芽孢乳桿菌（Sporolactobacillus inulinus），本實驗室保藏。

1.2 ?培養基和培養方法

斜面培養基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，酵母抽提物0.5%，葡萄糖2%，檸檬酸銨0.2%，磷酸氫二鉀0.2%，乙酸鈉0.5%，吐溫80 0.1%，硫酸鎂0.02%，硫酸錳0.005%， 瓊脂2%，115 ℃滅菌30 min，pH 6.2～6.5。

種子培養基（液體MRS）：蛋白胨1%，牛肉膏1%，酵母抽提物0.5%，葡萄糖 2%，檸檬酸銨0.2%，磷酸氫二鉀0.2%，乙酸鈉0.5%，吐溫80 0.1%，硫酸鎂0.02%，硫酸錳0.005%，115 ℃滅菌30 min，pH 6.2～6.5。

發酵培養基：蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，酵母抽提物0.5%，葡萄糖10%，磷酸氫二鉀0.2%，乙酸鈉0.3%，硫酸鎂0.01%，發酵前一次性添加碳酸鈣5%，115 ℃滅菌30 min，pH 6.5。

碳酸鈣初篩平板培養基：在上述斜面培養基基礎上加入碳酸鈣5%。

1.3 ?誘變方法

1.3.1 ?細胞懸浮液的制備 ?取活化后的斜面菌種一環，接入50 mL種子培養基，37 ℃搖床培養24 h后，取10 mL轉入100 mL種子培養基中，37 ℃搖床培養至對數生長期，取10 mL該培養液，8 000 r/min離心10 min，收集菌體，菌體用10 mL生理鹽水離心洗滌2次，用玻璃珠振蕩分散，然后將菌體充分懸浮于10 mL生理鹽水中。使細胞濃度為l08 個/mL，細胞懸浮液的濃度采用平板計數法測定。

1.3.2 ?紫外線處理 ?紫外致死率曲線的制作：分別取1 mL菌懸液于無菌培養皿中，置于紫外燈下30 cm處，開啟15 W紫外燈，預熱20 min，在磁力攪拌下，打開皿蓋，分別照射0、5、10、15、20、25、30、35、40、45 s，然后取不同時間誘變處理的0.5 mL菌液進行適當稀釋后，涂布于碳酸鈣初篩平板上，37 ℃避光培養48 h，計算每皿菌落數。計算致死率并繪制曲線。

致死率=（A-B）/A×100%（A為對照組平皿上的菌落數，B為不同時間誘變處理后平皿上的菌落數）

選擇致死率為70%～80%的處理時間作為最佳誘變時間[7]，并在此時間下進行紫外線誘變處理。

1.3.3 ?硫酸二乙酯（DES）誘變 ?取硫酸二乙酯原液5 mL，加入到5 mL無水乙醇搖勻溶解，將經紫外誘變得到的誘變菌株制備菌懸液與硫酸二乙酯溶液混勻，自加入硫酸二乙酯溶液后開始計時，在37 ℃、160 r/min的搖床內振蕩反應，處理一定時間后加入硫代硫酸鈉溶液終止反應，并涂布于碳酸鈣初篩平板上，37 ℃避光培養48 h，計算每皿的菌落數。計算致死率（計算方法同紫外誘變）并繪制曲線。

1.4 ?誘變菌株的篩選

1.4.1 ?初篩 ?將經過誘變處理的菌液涂布于碳酸鈣初篩平板上，37 ℃避光培養48 h后，觀察變色圈的大小，測定變色圈直徑和菌落直徑之比（即HC值），挑選HC值大的菌株保藏。

1.4.2 復篩

1）種子液制備。取初篩獲得的菌株一環接入50 mL種子培養基，37 ℃搖床培養24 h后，取10 mL轉入100 mL種子培養基，37 ℃搖床培養24 h即得。

2）發酵復篩。將上述種子液以5%的接種量轉入裝有50 mL發酵培養基的250 mL三角瓶，37 ℃搖床發酵培養72 h，測定其D-乳酸含量，選取產量高的菌株保存。

3）遺傳穩定性試驗。選取誘變后得到D-乳酸含量較高的變異菌株連續傳代7次，測定D-乳酸含量。

1.5 ?分析方法

1.5.1 ?D-乳酸含量的測定 ?采用高效液相色譜法，色譜分離柱：Diamonsil C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）; 檢測器：紫外檢測器;波長：210 nm;流速：0.5 mL/min;柱溫：35 ℃;流動相：0.2 mmol的硫酸銅。

1.5.2 ?總酸含量的測定 ?采用EDTA定鈣滴定法[8]。

2 ?結果與分析

2.1 ?出發菌株生長曲線

出發菌株菊糖芽孢乳桿菌在MRS液體培養基中，37 ℃搖床培養的生長曲線見圖1。從圖1可看出，該菌株的對數生長期為16～28 h，根據此對數生長期，選取培養時間為24 h的細胞作為誘變用細胞。

2.2 ?菊糖芽孢乳桿菌的誘變

2.2.1 ?紫外線處理對出發菌株存活的影響 ?紫外線對出發菌株的誘變致死曲線見圖2。從圖2可知，隨著紫外線照射時間延長，菊糖芽孢乳桿菌的致死率逐漸升高，有研究表明，較低劑量容易出現正突變，一般選擇致死率為70%～80%的劑量。從紫外線致死曲線可看出，當照射時間為20 s時致死率達到80.7%。因此選擇20 s作為紫外誘變的最佳誘變時間。

2.2.2 ?紫外線誘變突變株的篩選

1）紫外誘變突變株的平板初篩。對L0紫外線誘變后，挑取單菌落，測定HC值，并進行編號，結果見表1。由表1可看出，在挑選的16株單菌落中有8株的HC值比出發菌株L0大。選擇這8株突變株進行發酵復篩。

2）紫外誘變突變株的發酵復篩。對HC值比出發菌株L0大的8株突變株進行發酵培養，由表2可以看出，U6、U8、U9的D-乳酸產量高于L0，而其他菌種的D-乳酸產量低于L0，說明僅有U6、U8、U9菌株發生了正向突變，其他菌種則發生了負向突變，所以對U6、U8、U9菌株進行穩定性試驗。

3）紫外誘變突變株的穩定性試驗。分別對這3株菌進行發酵傳代試驗，每株菌傳代7次，從表3中可以看出，3株菌的遺傳穩定性均較好，但是U6的乳酸產量最高，所以選擇U6紫外誘變菌株進行下一步試驗。

2.2.3 ?硫酸二乙酯（DES）誘變突變株的選育結果

1）硫酸二乙酯誘變致死曲線的繪制。DES對紫外誘變菌株U6的誘變致死曲線見圖3。從圖3可知，隨著DES作用時間的延長，U6菌株的致死率逐漸升高。從DES致死曲線可看出，當處理時間為25 min時致死率大約為80%。因此選擇25 min作為硫酸二乙酯誘變的最佳誘變時間。

2）DES誘變突變株的平板初篩。對U6菌株進行DES誘變后，挑取單菌落，測定HC值，并進行編號，結果見表4。由表4可看出，在挑選的13株單菌落中有7株的HC值比出發菌株U6大，所以選擇這7株突變株進行發酵復篩。

3）硫酸二乙酯誘變突變株的發酵復篩。對HC值比出發菌株U6大的7株突變株進行發酵培養，結果見表5。經反復試驗，D1、D5、D10和D11的D-乳酸產量均高于U6。所以選用這4株誘變菌株進行第二輪搖瓶發酵復篩試驗。

4）DES誘變突變株的遺傳穩定性試驗。分別將這4株菌連續傳代7次，每代分別進行發酵測定D-乳酸產量，結果見表6。從表6中可以看出，4株菌的遺傳穩定性均較好，但是D11誘變菌株的乳酸產量最高，而且每一代的乳酸產量變化不大，故選擇突變株D11為目標菌株。

2.3 ?對誘變菌株發酵條件的研究

在得到一株遺傳穩定性好的菌株后，需要對其發酵條件進行研究。試驗就其發酵時間、發酵溫度、初始pH、轉速、接種量和裝液量進行了單因素試驗驗（圖4）。從圖4中可以得出，在發酵時間為68 h，發酵溫度為37 ℃，初始pH為6.5，轉速為160 r/min，接種量為5%，裝液量為50 mL/250 mL是該紫外、硫酸二乙酯誘變菌株的最佳誘變條件。

在最佳發酵條件下，對該菌株進行驗證發酵試驗，D-乳酸的產量達到56.18 g/L，表明此發酵條件的可行。

3 ?小結與討論

通過對L0進行紫外線和硫酸二乙酯的誘變，碳酸鈣平板初篩及搖瓶發酵復篩，從大量突變株中篩選得到一株D-乳酸變異菌株D11，其D-乳酸的產量從最初的37.57 g/L提高到50.84 g/L，提高了35.32%。連續傳代7次，D-乳酸產量變化不大，說明該突變菌株具有較好的遺傳穩定性，之后又通過對發酵條件的單因素試驗，結果表明在發酵時間為68 h，發酵溫度為37 ℃，初始pH為6.5，轉速為160 r/min，接種量為5%，裝液量為50 mL/250 mL時，該誘變菌株的D-乳酸產量達到了56.18 g/L，比出發菌種提高了49.53%。與付衛明[9]、李小平等[10]的研究結果相比，本試驗的發酵時間明顯縮短，紫外照射時間明顯減少，但是D-乳酸產量仍然較高，且與出發菌株相比，D-乳酸的產量增高明顯。而且此誘變條件操作簡單，容易達到，成本節約，也為該菌的工業化生產D-乳酸奠定了一定的基礎。

參考文獻：

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[10] 李小平，魏玲玲，張慧發，等.保加利亞乳桿菌乳酸高產菌株的紫外誘變選育[J].山西農業大學學報（自然科學版），2010，30（1）：88-90.

3）紫外誘變突變株的穩定性試驗。分別對這3株菌進行發酵傳代試驗，每株菌傳代7次，從表3中可以看出，3株菌的遺傳穩定性均較好，但是U6的乳酸產量最高，所以選擇U6紫外誘變菌株進行下一步試驗。

2.2.3 ?硫酸二乙酯（DES）誘變突變株的選育結果

1）硫酸二乙酯誘變致死曲線的繪制。DES對紫外誘變菌株U6的誘變致死曲線見圖3。從圖3可知，隨著DES作用時間的延長，U6菌株的致死率逐漸升高。從DES致死曲線可看出，當處理時間為25 min時致死率大約為80%。因此選擇25 min作為硫酸二乙酯誘變的最佳誘變時間。

2）DES誘變突變株的平板初篩。對U6菌株進行DES誘變后，挑取單菌落，測定HC值，并進行編號，結果見表4。由表4可看出，在挑選的13株單菌落中有7株的HC值比出發菌株U6大，所以選擇這7株突變株進行發酵復篩。

3）硫酸二乙酯誘變突變株的發酵復篩。對HC值比出發菌株U6大的7株突變株進行發酵培養，結果見表5。經反復試驗，D1、D5、D10和D11的D-乳酸產量均高于U6。所以選用這4株誘變菌株進行第二輪搖瓶發酵復篩試驗。

4）DES誘變突變株的遺傳穩定性試驗。分別將這4株菌連續傳代7次，每代分別進行發酵測定D-乳酸產量，結果見表6。從表6中可以看出，4株菌的遺傳穩定性均較好，但是D11誘變菌株的乳酸產量最高，而且每一代的乳酸產量變化不大，故選擇突變株D11為目標菌株。

2.3 ?對誘變菌株發酵條件的研究

在得到一株遺傳穩定性好的菌株后，需要對其發酵條件進行研究。試驗就其發酵時間、發酵溫度、初始pH、轉速、接種量和裝液量進行了單因素試驗驗（圖4）。從圖4中可以得出，在發酵時間為68 h，發酵溫度為37 ℃，初始pH為6.5，轉速為160 r/min，接種量為5%，裝液量為50 mL/250 mL是該紫外、硫酸二乙酯誘變菌株的最佳誘變條件。

在最佳發酵條件下，對該菌株進行驗證發酵試驗，D-乳酸的產量達到56.18 g/L，表明此發酵條件的可行。

3 ?小結與討論

通過對L0進行紫外線和硫酸二乙酯的誘變，碳酸鈣平板初篩及搖瓶發酵復篩，從大量突變株中篩選得到一株D-乳酸變異菌株D11，其D-乳酸的產量從最初的37.57 g/L提高到50.84 g/L，提高了35.32%。連續傳代7次，D-乳酸產量變化不大，說明該突變菌株具有較好的遺傳穩定性，之后又通過對發酵條件的單因素試驗，結果表明在發酵時間為68 h，發酵溫度為37 ℃，初始pH為6.5，轉速為160 r/min，接種量為5%，裝液量為50 mL/250 mL時，該誘變菌株的D-乳酸產量達到了56.18 g/L，比出發菌種提高了49.53%。與付衛明[9]、李小平等[10]的研究結果相比，本試驗的發酵時間明顯縮短，紫外照射時間明顯減少，但是D-乳酸產量仍然較高，且與出發菌株相比，D-乳酸的產量增高明顯。而且此誘變條件操作簡單，容易達到，成本節約，也為該菌的工業化生產D-乳酸奠定了一定的基礎。

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3）紫外誘變突變株的穩定性試驗。分別對這3株菌進行發酵傳代試驗，每株菌傳代7次，從表3中可以看出，3株菌的遺傳穩定性均較好，但是U6的乳酸產量最高，所以選擇U6紫外誘變菌株進行下一步試驗。

2.2.3 ?硫酸二乙酯（DES）誘變突變株的選育結果

1）硫酸二乙酯誘變致死曲線的繪制。DES對紫外誘變菌株U6的誘變致死曲線見圖3。從圖3可知，隨著DES作用時間的延長，U6菌株的致死率逐漸升高。從DES致死曲線可看出，當處理時間為25 min時致死率大約為80%。因此選擇25 min作為硫酸二乙酯誘變的最佳誘變時間。

2）DES誘變突變株的平板初篩。對U6菌株進行DES誘變后，挑取單菌落，測定HC值，并進行編號，結果見表4。由表4可看出，在挑選的13株單菌落中有7株的HC值比出發菌株U6大，所以選擇這7株突變株進行發酵復篩。

3）硫酸二乙酯誘變突變株的發酵復篩。對HC值比出發菌株U6大的7株突變株進行發酵培養，結果見表5。經反復試驗，D1、D5、D10和D11的D-乳酸產量均高于U6。所以選用這4株誘變菌株進行第二輪搖瓶發酵復篩試驗。

4）DES誘變突變株的遺傳穩定性試驗。分別將這4株菌連續傳代7次，每代分別進行發酵測定D-乳酸產量，結果見表6。從表6中可以看出，4株菌的遺傳穩定性均較好，但是D11誘變菌株的乳酸產量最高，而且每一代的乳酸產量變化不大，故選擇突變株D11為目標菌株。

2.3 ?對誘變菌株發酵條件的研究

在得到一株遺傳穩定性好的菌株后，需要對其發酵條件進行研究。試驗就其發酵時間、發酵溫度、初始pH、轉速、接種量和裝液量進行了單因素試驗驗（圖4）。從圖4中可以得出，在發酵時間為68 h，發酵溫度為37 ℃，初始pH為6.5，轉速為160 r/min，接種量為5%，裝液量為50 mL/250 mL是該紫外、硫酸二乙酯誘變菌株的最佳誘變條件。

在最佳發酵條件下，對該菌株進行驗證發酵試驗，D-乳酸的產量達到56.18 g/L，表明此發酵條件的可行。

3 ?小結與討論

通過對L0進行紫外線和硫酸二乙酯的誘變，碳酸鈣平板初篩及搖瓶發酵復篩，從大量突變株中篩選得到一株D-乳酸變異菌株D11，其D-乳酸的產量從最初的37.57 g/L提高到50.84 g/L，提高了35.32%。連續傳代7次，D-乳酸產量變化不大，說明該突變菌株具有較好的遺傳穩定性，之后又通過對發酵條件的單因素試驗，結果表明在發酵時間為68 h，發酵溫度為37 ℃，初始pH為6.5，轉速為160 r/min，接種量為5%，裝液量為50 mL/250 mL時，該誘變菌株的D-乳酸產量達到了56.18 g/L，比出發菌種提高了49.53%。與付衛明[9]、李小平等[10]的研究結果相比，本試驗的發酵時間明顯縮短，紫外照射時間明顯減少，但是D-乳酸產量仍然較高，且與出發菌株相比，D-乳酸的產量增高明顯。而且此誘變條件操作簡單，容易達到，成本節約，也為該菌的工業化生產D-乳酸奠定了一定的基礎。

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