費烏瑞它馬鈴薯莖尖分化成苗的培養基篩選與病毒的RT—PCR檢測

馮光惠+杜虎平+李夏隆+亢福仁

摘要：以分別攜帶3種病毒（PVX、PVY、PLRV）和紡錘塊莖類病毒（PSTVd）的費烏瑞它（Favorita）馬鈴薯（Solanum tuberosum）無菌苗為材料，38 ℃、4 h熱處理4周，剝離帶1個葉原基的莖尖，接種至不同濃度激素組合的24種MS固體培養基上，24 ℃、16 h培養15 d后統計莖尖的愈傷組織誘導率和分化成苗率;反轉錄PCR（RT-PCR）檢測莖尖分化再生苗的脫毒率。結果表明，最適宜費烏瑞它馬鈴薯莖尖分化成苗的培養基為MS+0.075 mg/L 6-BA +0.05 mg/L NAA +0.10 mg/L GA3，愈傷組織誘導率為75%，分化成苗率為47.5%;再生苗3種病毒PVX、PVY和PLRV的脫毒率分別為65%、90%和100%，紡錘塊莖類病毒PSTVd的脫毒率為10%。

關鍵詞：費烏瑞它馬鈴薯（Solanum tuberosum）;莖尖;分化成苗;培養基;RT-PCR檢測

中圖分類號：S532 ? ? ? 文獻標識碼：A ? ? ? 文章編號：0439-8114（2014）20-4988-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.060

Screening the Culture Medium of Favorita Potato Meristem Differentiation

Seedlings and RT-PCR Detection of Virus

FENG Guang-hui， DU Hu-ping， LI Xia-long， KANG Fu-ren

（College of Life Science，Yulin University， Yulin 719000，Shaanxi，China）

Abstract： Aseptic seedlings of Favorita potato carrying three kinds of potato viruses（PVX，PVY，PLRV） and potato spindle tuber viroid （PSTVd） were treated with 38 ℃，4 hours for 4 weeks， stripped with oneleaf primordia of potato meristem，inoculated with 24 kinds of MS solid media of different hormone combinations. The callus induction rate of meristem and differentiation seedling rate after cultured by 24 ℃，16 hours for 15 days were determined statistically. Reverse transcription PCR （RT-PCR） was used to detect the virus-free rate of meristem regeneration. The results showed that the best meristem differentiation medium was MS+0.075 mg/L 6-BA +0.05 mg/L NAA+0.10 mg/L GA3 with the callus inductionrate of 75% and differentiation seedling rate of 47.5%. The rate of detoxification of regenerated plantlets of three potato virus PVX，PVY and PLRV were 65%，90% and 100%. The virus-free rate of potato spindle tuber viroid was 10%.

Key words： Favorita potato; meristem; differentiation seedling; culture medium; RT-PCR detection

脫除馬鈴薯（Solanum tuberosum）病毒和紡錘塊莖類病毒（以下簡稱類病毒）主要采用莖尖組織培養法，并結合熱處理[1]、低溫療法[2]和病毒唑法[3]等提高脫毒效果。其中，熱處理結合莖尖組織培養法是一種應用較廣的馬鈴薯脫毒方法，在葡萄（Vitis vinifera）、草莓（Fragaria×ananassa Duch.）和蘋果（Malus pumila）等植物上也有報道。但由于不同植物或同一植物不同品種基因型和生理特性的差異，莖尖分化成苗的難易程度也不一樣。以蓋瓊輝等[4]、Iqbal等[5]研究的馬鈴薯莖尖分化成苗培養基作為參考，在同一培養基上對克新1號、夏波蒂、費烏瑞它、隴薯3號、布爾班克、青薯9號、早大白、冀張薯8號等品種的莖尖培養后發現，這些品種莖尖分化成苗所需的最適培養基不盡相同，其中，費烏瑞它品種較難成苗，夏波蒂品種最難成苗。費烏瑞它馬鈴薯是榆林地區近年來引進的優良品種之一，該品種具有抗性強、產量高、品質優的特點。但隨著種植年代的增加，不同病毒或類病毒在塊莖體內不斷積累，造成產量和品質逐年下降。因此，及時、有效地控制病毒的傳播是做好脫毒馬鈴薯產業的關鍵。目前，國內關于費烏瑞它馬鈴薯莖尖分化成苗的文獻報道較少[6-8]。本研究針對費烏瑞它馬鈴薯莖尖分化成苗率較低的原因，以熱處理結合莖尖剝離脫除病毒和類病毒為目標，篩選費烏瑞它馬鈴薯莖尖分化成苗最適宜的培養基，并通過RT-PCR方法檢測再生苗病毒和類病毒的脫毒率，為脫毒苗擴繁和種薯繁育奠定基礎。endprint

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?帶毒費烏瑞它馬鈴薯無菌苗 ?采集田間疑似帶毒馬鈴薯植株的塊莖，低溫休眠后，室溫暗處催芽，消毒后接種在MS固體培養基上培養，待成苗后擴繁，從而建立馬鈴薯無菌苗體系。用RT-PCR方法檢測并挑選分別含有3種病毒（PVX、PVY、PLRV）和紡錘塊莖類病毒（PSTVd）的2種材料，由榆林學院生命科學學院保存備用。

1.1.2 ?藥品和試劑 ?培養基及不同植物生長調節劑所含藥品，均購自北京康貝斯生物科技有限公司;病毒檢測的Trizol試劑購自invitrogen公司;cDNA合成試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTP、瓊脂糖等購自北京全式金生物科技有限公司。

1.1.3 ?引物設計及合成 ?根據GenBank數據庫上PVX、PVY、PLRV的CP基因序列和PSTVd全基因組序列，利用軟件Primer 5設計4對特異引物，分別是：PVX-F：5′-ACAGGCCACAGGGTCAACTAC-3′，PVX-R：5′-CATCTAGGCTGGCAAAGTCGT-3′;PVY-F：5′-GCCAACTGTGATGAATGGGC-3′，PVY-R：5′-TGTACTGATGCCACCGTCCA-3′;PLRV-F：5′-CGCGCTAACAGAGTTCAGCC-3′，PLRV-R：5′-GCAATGGGGGTCCAACTCAT-3′;PSTVd-F：5′-GATCCCCGGGGAAACCTGGAGC-3′，PSTVd-R：5′-GATCCCTGAAGCGCTCCTCCGAG-3′。

預期PVX、PVY、PLRV的CP基因序列和PSTVd全基因組序列的擴增片段大小分別為620、400、336和251 bp。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，用滅菌TE（pH 8.0）稀釋至濃度為10 μmol/L。

1.2 ?方法

1.2.1 ?熱處理 ?取生長至高約1～2 cm的馬鈴薯無菌苗，在植物培養箱內升溫1 ℃/d馴化20 d左右，然后38 ℃光照培養4 h、24 ℃光照培養12 h，光照度3 000 lx，最后20 ℃暗培養8 h，變溫熱處理4周以鈍化病毒。

1.2.2 ?培養基組成 ?以MS為基本培養基，添加不同質量濃度配比的植物生長調節劑，其中，細胞分裂素6-BA的6個濃度分別為0、0.025、0.050、0.075、0.100、0.150 mg/L，生長素NAA的4個濃度分別為0、0.025、0.050、0.075 mg/L，赤霉素GA3的濃度為0.100 mg/L，共組成24種培養基，蔗糖30 g/L，卡拉膠5 g/L，pH 5.8。

1.2.3 ?莖尖剝離與接種 ?剪取熱處理后長勢較好的無菌苗（部分擴繁無菌苗因耐熱差而長勢弱或死亡），以注射器針代替解剖針在40倍的體視顯微鏡下進行莖尖剝離。因剝離莖尖越大，成活率越高，但脫毒率低，為提高再生苗的脫毒率，試驗全部剝離帶1個葉原基的莖尖，莖尖大小約0.1～0.2 mm，壯苗莖尖稍大，弱細苗莖尖稍小。培養溫度24 ℃，光照時間16 h/d，光照度3 000 lx。

為了降低污染率，每個試管只接種1個莖尖，每個處理的培養基接種40個莖尖。8 d后觀察并記錄莖尖生長情況，15 d后統計莖尖的愈傷組織誘導率、分化成苗率。愈傷組織誘導率=形成愈傷組織個數/接種莖尖個數×100%;分化成苗率=分化成苗個數/接種莖尖個數×100%。

1.2.4 ?RT-PCR檢測 ?為檢測馬鈴薯莖尖剝離再生苗病毒和類病毒的脫除情況，隨機挑選熱處理前攜帶3種病毒（PVX、PVY、PLRV）和類病毒（PSTVd）且莖尖剝離分化后長勢良好的再生苗各20株，擴繁2代后分別以RT-PCR法進行病毒檢測。Trizol法提取馬鈴薯再生苗葉片總RNA，反轉錄（RT）合成cDNA，PCR分別擴增不同病毒和類病毒的目的基因片段，1.5%瓊脂糖凝膠電泳PCR產物。PCR反應體系為：模板DNA 3 μL，正向（F）引物1 μL，反向（R）引物1 μL，10×PCR Buffer 5 μL，2.5mmol/L dNTPs 4 μL，TaqDNA聚合酶1 μL，加ddH2O至50 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，PVX、PSTVd 50 ℃（PVY、PLRV 59 ℃）退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環;72 ℃延伸10 min。

2 ?結果與分析

2.1 ?不同激素組合的培養基對莖尖分化成苗的影響

從表1可以看出，剝離帶1個葉原基的莖尖接種在不同激素組合的24種培養基中均能形成愈傷組織，F06培養基的愈傷組織誘導率最低，為37.5%;F13和F19培養基愈傷組織誘導率最高，為82.5%，表明費烏瑞它馬鈴薯的莖尖分生組織容易發生脫分化。但是莖尖分化成苗率相對低且差異較大，F19培養基沒有分化成苗，F16培養基誘導愈傷組織再分化的能力最高，分化成苗率達47.5%，F17和F23培養基的分化成苗率也比較高，分別為37.5%和32.5%。所以，最適合費烏瑞它馬鈴薯的莖尖分化成苗的培養基為MS+0.075 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA +0.10 mg/L GA3。

2.2 ?費烏瑞它馬鈴薯莖尖分化成苗過程分析

觀察莖尖生長點的生長情況發現，除由莖尖剝離技術引起生長點破壞或接種速度慢造成莖尖失水而死亡外，8～12 d時均能形成淺綠色的愈傷組織。15 d 后愈傷組織可分化出幼芽和單條主根（圖1a），30 d后觀察成苗情況發現，除F19培養基只形成愈傷組織和根系而不能分化成苗外（圖1b），其他23種培養基均能誘導愈傷組織分化成苗。不同培養基誘導分化再生苗的生長勢有所差異，分化成苗率低的培養基，再生苗一般表現出植株莖干矮小纖細（圖1c）或莖干粗細不均、葉片稀少（圖1d）等現象;分化成苗率高的培養基，如F16、F17培養基上生長的再生苗生長勢多數較好，表現為植株莖桿健壯均勻、葉片大而綠、根系多且發達（圖1e、圖1f）。由于通過愈傷組織形成再生苗可能發生變異，試驗中發現個別再生苗雖生長健壯卻失去費烏瑞它莖干原有的紫紅色，葉片和莖干均為綠色（圖1g），但擴繁后的再生苗又恢復了莖干的紫紅色，是否發生變異還需通過逐代繁殖的田間植株表現來驗證或分子遺傳學分析鑒定。endprint

2.3 ?再生苗病毒和類病毒的RT-PCR檢測

凝膠成像檢測發現，馬鈴薯莖尖剝離脫毒前后RT-PCR電泳條帶差異明顯（圖2），其中，2、4、6、8泳道為脫毒前的檢測結果，均擴增出不同病毒和類病毒的目的條帶;3、5、7泳道和9泳道沒有擴增出目的條帶，表明被檢測再生苗不含病毒PVX、PVY、PLRV或類病毒PSTVd;部分再生苗的RT-PCR產物檢測出目的條帶，表明還未脫除相應的病毒或類病毒。

檢測20株再生苗3種病毒PVX、PVY和PLRV后發現，20株全部不攜帶PLRV，18株不攜帶PVY，13株不攜帶PVX。2株攜帶PVY的再生苗同時攜帶PVX，表明X病毒較難脫除，Y病毒次之，卷葉病毒最容易脫除，3種病毒PVX、PVY和PLRV的脫毒率分別為65%、90%和100%。由類病毒PSTVd的檢測結果發現，20株再生苗中有2株脫除了類病毒，脫毒率為10%，表明熱處理結合莖尖剝離脫毒法很難脫除PSTVd。

3 ?小結與討論

3.1 ?莖尖脫毒與分化成苗

熱處理結合莖尖組織培養法是國內外普遍應用的馬鈴薯脫毒技術，能有效地脫除危害馬鈴薯生長的常見病毒和類病毒，如PVX、PVY、PLRV、PVS、PVA、PVM和PSTVd等。但是，不同病毒脫除難易差別較大，對一般馬鈴薯品種而言，通常PVS、PVX較難脫除，PLRV容易脫除，本研究的試驗結果和國外一些學者[9-11]研究的結論是一致的。對于PVS、PVX等較難脫除的病毒，主要采用的是熱處理、低溫療法和病毒唑法等結合莖尖組織培養法。而脫除馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd，目前仍沒有理想的方法，主要以篩選田間抗類病毒植株的塊莖為主。在檢測無體細胞變異的情況下，以二次或多次莖尖剝離法來提高類病毒的脫毒效果，但必需淘汰可能變異的組培苗，典型費烏瑞它馬鈴薯組培苗應具有紫紅色莖干和葉片，首先從顏色上去除疑似變異組培苗，完全淘汰變異植株還需通過逐代繁殖的田間植株表現來驗證或分子遺傳學分析鑒定。莖尖組織培養法實質是剝離莖尖生長點的分生組織，剝離莖尖大小與脫毒程度有直接關系，剝離莖尖大，不易脫毒，剝離莖尖小，病毒易脫除但不易成活。本試驗為獲得脫毒效果更好的再生苗，以剝離帶1個葉原基的莖尖為外植體，但同時降低了莖尖分化成苗率，與國內多數學者剝離帶1～2或2～3個葉原基的試驗區別較大。

不同品種的馬鈴薯由于基因型和生理特性不同，需要不同的培養基環境。因此，篩選不同濃度激素及合適配比的培養基，對提高馬鈴薯莖尖分化成苗效果尤為重要。通過對不同品種莖尖分化成苗的培養基篩選試驗發現，費烏瑞它馬鈴薯是較難分化成苗的一個品種，雖然F16、F17和F23培養基的分化成苗率較高，在此基礎上還可探索更合適的培養基，由于培養環境、其他類型激素組合的培養基對莖尖分化成苗的影響也需進一步去研究。

3.2 ?病毒檢測

目前，國內外檢測馬鈴薯病毒的方法主要采用DAS-ELISA法和RT-PCR法，而馬鈴薯紡錘塊莖類病毒只含有核酸，沒有外殼蛋白，只能用RT-PCR法進行檢測。在RT-PCR基礎上，進一步發展了熒光定量及多重RT-PCR檢測技術，能更好地提高病毒檢測效率。DAS-ELISA法簡單、實用，但容易出現假陰性現象，對病毒含量低的馬鈴薯檢測效果差;熒光定量及多重RT-PCR檢測技術是比較先進的馬鈴薯病毒檢測技術，但對引物設計及PCR反應體系要求較嚴格，也易出現假陰性現象。RT-PCR檢測技術是一種快速、準確、可靠的檢測方法，只要在反應體系中改變不同病毒或類病毒的特異引物，就能同時檢測多種馬鈴薯病毒或類病毒，試驗準確率高，且有效克服了假陰性現象，對同時檢測較多馬鈴薯樣品的病毒或類病毒更經濟實用、快速準確。

參考文獻：

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[7] 李 ?娟，程智慧，張國裕.四個馬鈴薯品種幼莖段再生技術的研究[J].西北農林科技大學學報，2006，34（3）：610-614.

[8] 邱 ?礽，陶 ?剛，朱 ?英，等.馬鈴薯品種莖段愈傷組織誘導和植株再生的研究[J].貴州農業科學，2009，37（10）：11-13.

[9] BIPASHA C， WANG-PRUSKI G F.Rapid regeneration of stable transformants in cultures of potato by improving factors influenceing agrobacterium-mediated transformation[J].Advances in Bioscience and Biotechnology， 2010，1：409-416.

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[11] MAMIDALA P， SWAMY R， NANNA. Efficient in vitro plant regeneration，flowering and fruiting of drawf Tomato cv.Micro-Msk[J].Plant Omics Journal，2009，2（3）：98-102.endprint

2.3 ?再生苗病毒和類病毒的RT-PCR檢測

凝膠成像檢測發現，馬鈴薯莖尖剝離脫毒前后RT-PCR電泳條帶差異明顯（圖2），其中，2、4、6、8泳道為脫毒前的檢測結果，均擴增出不同病毒和類病毒的目的條帶;3、5、7泳道和9泳道沒有擴增出目的條帶，表明被檢測再生苗不含病毒PVX、PVY、PLRV或類病毒PSTVd;部分再生苗的RT-PCR產物檢測出目的條帶，表明還未脫除相應的病毒或類病毒。

檢測20株再生苗3種病毒PVX、PVY和PLRV后發現，20株全部不攜帶PLRV，18株不攜帶PVY，13株不攜帶PVX。2株攜帶PVY的再生苗同時攜帶PVX，表明X病毒較難脫除，Y病毒次之，卷葉病毒最容易脫除，3種病毒PVX、PVY和PLRV的脫毒率分別為65%、90%和100%。由類病毒PSTVd的檢測結果發現，20株再生苗中有2株脫除了類病毒，脫毒率為10%，表明熱處理結合莖尖剝離脫毒法很難脫除PSTVd。

3 ?小結與討論

3.1 ?莖尖脫毒與分化成苗

熱處理結合莖尖組織培養法是國內外普遍應用的馬鈴薯脫毒技術，能有效地脫除危害馬鈴薯生長的常見病毒和類病毒，如PVX、PVY、PLRV、PVS、PVA、PVM和PSTVd等。但是，不同病毒脫除難易差別較大，對一般馬鈴薯品種而言，通常PVS、PVX較難脫除，PLRV容易脫除，本研究的試驗結果和國外一些學者[9-11]研究的結論是一致的。對于PVS、PVX等較難脫除的病毒，主要采用的是熱處理、低溫療法和病毒唑法等結合莖尖組織培養法。而脫除馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd，目前仍沒有理想的方法，主要以篩選田間抗類病毒植株的塊莖為主。在檢測無體細胞變異的情況下，以二次或多次莖尖剝離法來提高類病毒的脫毒效果，但必需淘汰可能變異的組培苗，典型費烏瑞它馬鈴薯組培苗應具有紫紅色莖干和葉片，首先從顏色上去除疑似變異組培苗，完全淘汰變異植株還需通過逐代繁殖的田間植株表現來驗證或分子遺傳學分析鑒定。莖尖組織培養法實質是剝離莖尖生長點的分生組織，剝離莖尖大小與脫毒程度有直接關系，剝離莖尖大，不易脫毒，剝離莖尖小，病毒易脫除但不易成活。本試驗為獲得脫毒效果更好的再生苗，以剝離帶1個葉原基的莖尖為外植體，但同時降低了莖尖分化成苗率，與國內多數學者剝離帶1～2或2～3個葉原基的試驗區別較大。

不同品種的馬鈴薯由于基因型和生理特性不同，需要不同的培養基環境。因此，篩選不同濃度激素及合適配比的培養基，對提高馬鈴薯莖尖分化成苗效果尤為重要。通過對不同品種莖尖分化成苗的培養基篩選試驗發現，費烏瑞它馬鈴薯是較難分化成苗的一個品種，雖然F16、F17和F23培養基的分化成苗率較高，在此基礎上還可探索更合適的培養基，由于培養環境、其他類型激素組合的培養基對莖尖分化成苗的影響也需進一步去研究。

3.2 ?病毒檢測

目前，國內外檢測馬鈴薯病毒的方法主要采用DAS-ELISA法和RT-PCR法，而馬鈴薯紡錘塊莖類病毒只含有核酸，沒有外殼蛋白，只能用RT-PCR法進行檢測。在RT-PCR基礎上，進一步發展了熒光定量及多重RT-PCR檢測技術，能更好地提高病毒檢測效率。DAS-ELISA法簡單、實用，但容易出現假陰性現象，對病毒含量低的馬鈴薯檢測效果差;熒光定量及多重RT-PCR檢測技術是比較先進的馬鈴薯病毒檢測技術，但對引物設計及PCR反應體系要求較嚴格，也易出現假陰性現象。RT-PCR檢測技術是一種快速、準確、可靠的檢測方法，只要在反應體系中改變不同病毒或類病毒的特異引物，就能同時檢測多種馬鈴薯病毒或類病毒，試驗準確率高，且有效克服了假陰性現象，對同時檢測較多馬鈴薯樣品的病毒或類病毒更經濟實用、快速準確。

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[8] 邱 ?礽，陶 ?剛，朱 ?英，等.馬鈴薯品種莖段愈傷組織誘導和植株再生的研究[J].貴州農業科學，2009，37（10）：11-13.

[9] BIPASHA C， WANG-PRUSKI G F.Rapid regeneration of stable transformants in cultures of potato by improving factors influenceing agrobacterium-mediated transformation[J].Advances in Bioscience and Biotechnology， 2010，1：409-416.

[10] HALTERMAN D， CHARKOWSKI A， VERCHOT J. Potato，viruses，and seed certification in the USA to provide healthy propagated tubers[J].Pest Technology，2012， 1：1-14.

[11] MAMIDALA P， SWAMY R， NANNA. Efficient in vitro plant regeneration，flowering and fruiting of drawf Tomato cv.Micro-Msk[J].Plant Omics Journal，2009，2（3）：98-102.endprint

2.3 ?再生苗病毒和類病毒的RT-PCR檢測

凝膠成像檢測發現，馬鈴薯莖尖剝離脫毒前后RT-PCR電泳條帶差異明顯（圖2），其中，2、4、6、8泳道為脫毒前的檢測結果，均擴增出不同病毒和類病毒的目的條帶;3、5、7泳道和9泳道沒有擴增出目的條帶，表明被檢測再生苗不含病毒PVX、PVY、PLRV或類病毒PSTVd;部分再生苗的RT-PCR產物檢測出目的條帶，表明還未脫除相應的病毒或類病毒。

檢測20株再生苗3種病毒PVX、PVY和PLRV后發現，20株全部不攜帶PLRV，18株不攜帶PVY，13株不攜帶PVX。2株攜帶PVY的再生苗同時攜帶PVX，表明X病毒較難脫除，Y病毒次之，卷葉病毒最容易脫除，3種病毒PVX、PVY和PLRV的脫毒率分別為65%、90%和100%。由類病毒PSTVd的檢測結果發現，20株再生苗中有2株脫除了類病毒，脫毒率為10%，表明熱處理結合莖尖剝離脫毒法很難脫除PSTVd。

3 ?小結與討論

3.1 ?莖尖脫毒與分化成苗

熱處理結合莖尖組織培養法是國內外普遍應用的馬鈴薯脫毒技術，能有效地脫除危害馬鈴薯生長的常見病毒和類病毒，如PVX、PVY、PLRV、PVS、PVA、PVM和PSTVd等。但是，不同病毒脫除難易差別較大，對一般馬鈴薯品種而言，通常PVS、PVX較難脫除，PLRV容易脫除，本研究的試驗結果和國外一些學者[9-11]研究的結論是一致的。對于PVS、PVX等較難脫除的病毒，主要采用的是熱處理、低溫療法和病毒唑法等結合莖尖組織培養法。而脫除馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd，目前仍沒有理想的方法，主要以篩選田間抗類病毒植株的塊莖為主。在檢測無體細胞變異的情況下，以二次或多次莖尖剝離法來提高類病毒的脫毒效果，但必需淘汰可能變異的組培苗，典型費烏瑞它馬鈴薯組培苗應具有紫紅色莖干和葉片，首先從顏色上去除疑似變異組培苗，完全淘汰變異植株還需通過逐代繁殖的田間植株表現來驗證或分子遺傳學分析鑒定。莖尖組織培養法實質是剝離莖尖生長點的分生組織，剝離莖尖大小與脫毒程度有直接關系，剝離莖尖大，不易脫毒，剝離莖尖小，病毒易脫除但不易成活。本試驗為獲得脫毒效果更好的再生苗，以剝離帶1個葉原基的莖尖為外植體，但同時降低了莖尖分化成苗率，與國內多數學者剝離帶1～2或2～3個葉原基的試驗區別較大。

不同品種的馬鈴薯由于基因型和生理特性不同，需要不同的培養基環境。因此，篩選不同濃度激素及合適配比的培養基，對提高馬鈴薯莖尖分化成苗效果尤為重要。通過對不同品種莖尖分化成苗的培養基篩選試驗發現，費烏瑞它馬鈴薯是較難分化成苗的一個品種，雖然F16、F17和F23培養基的分化成苗率較高，在此基礎上還可探索更合適的培養基，由于培養環境、其他類型激素組合的培養基對莖尖分化成苗的影響也需進一步去研究。

3.2 ?病毒檢測

目前，國內外檢測馬鈴薯病毒的方法主要采用DAS-ELISA法和RT-PCR法，而馬鈴薯紡錘塊莖類病毒只含有核酸，沒有外殼蛋白，只能用RT-PCR法進行檢測。在RT-PCR基礎上，進一步發展了熒光定量及多重RT-PCR檢測技術，能更好地提高病毒檢測效率。DAS-ELISA法簡單、實用，但容易出現假陰性現象，對病毒含量低的馬鈴薯檢測效果差;熒光定量及多重RT-PCR檢測技術是比較先進的馬鈴薯病毒檢測技術，但對引物設計及PCR反應體系要求較嚴格，也易出現假陰性現象。RT-PCR檢測技術是一種快速、準確、可靠的檢測方法，只要在反應體系中改變不同病毒或類病毒的特異引物，就能同時檢測多種馬鈴薯病毒或類病毒，試驗準確率高，且有效克服了假陰性現象，對同時檢測較多馬鈴薯樣品的病毒或類病毒更經濟實用、快速準確。

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