正交試驗法優選五味溫通除痹膠囊水提工藝

張玉婷，高家榮，劉 健，韓燕全，姜 輝，吳 健，劉 娟，羅 歡

(1.安徽中醫藥大學第一附屬醫院，國家中醫藥管理局中藥制劑三級實驗室;2.安徽中醫藥大學，安徽合肥 230031)

五味溫通除痹膠囊是安徽中醫藥大學第一附屬醫院風濕科劉健教授根據多年臨床經驗研制的驗方，處方由淫羊藿、茯苓、黃芩、片姜黃、桂枝等5味中藥組成;具有溫陽通脈，散寒止痛的功效，主要治療類風濕性關節炎、強直性脊柱炎、骨關節炎、寒濕痹阻型所致的關節疼痛、腫脹，畏寒怕冷等病癥［1－2］。為優化其制備工藝，本試驗采用 L9(34)正交設計試驗方法，通過對水提工藝影響較大的因素如提取次數、提取時間、加水量等因素進行考察。由于淫羊藿是方中的君藥，故以淫羊藿苷提取率、浸膏得率為評價指標進行綜合評定，優選出該制劑的最佳水提工藝，為優化其制備工藝提供實驗依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters Acquity H-Class UPLC超高效液相色譜儀(美國Waters公司)，包括四元高壓梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器以及Empower2數據處理工作站;BP211D電子天平(德國塞多利斯公司);PTHW型調溫電熱套(鞏義市予華儀器有限責任公司);HH－S型水浴鍋(鄭州長城科工貿有限公司);真空干燥箱(上海博遠實業有限公司);KQ3200DB型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 淫羊藿苷對照品(含量測定用，批號110737－200312)，購自中國藥品生物制品檢定所;處方藥材飲片均由安徽中醫藥大學第一附屬醫院中藥房提供，經李立華主任中藥師鑒定均符合《中國藥典》(2010版)一部規定;甲醇、乙腈均為色譜純(美國Tedia公司);水為屈臣氏蒸餾水;其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 正交試驗設計 根據本處方中君藥的主要有效成分的化學性質及預實驗結果，采用L9(34)正交表安排試驗方案，考察主要因素加水量(A)、提取時間(B)、提取次數(C)，以淫羊藿苷提取率、浸膏得率為評價指標進行綜合評分(權重系數分別為0.6、0.4)，優選最佳水提工藝。正交試驗因素水平設計見表1。

表1 正交試驗因素水平表

按處方配比稱取各藥材9份，根據正交試驗設計的條件進行加熱回流，合并提取液、濾過，減壓濃縮，備用。

2.2 淫羊藿苷含量的測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱:Acquity BEH C18柱(100 mm × 2.1 mm，1.7 μm);流動相:乙腈 － 水(27∶73);柱溫:22℃;流速:0.2 mL·min－1;檢測波長:270 nm;進樣量:1.0 μL。見圖1。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取淫羊藿苷對照品適量，精密加入甲醇制成含淫羊藿苷0.16 g·L－1的對照品溶液母液，備用。

2.2.3 供試品溶液的制備 將干浸膏研成粉末，過60目篩，稱定1 g置錐形瓶中，加入稀乙醇20 mL，稱定重量，超聲處理(功率100 W，頻率40 Hz)1 h，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液即得。

2.2.4 陰性對照品溶液及原藥材溶液的制備按處方比例，取除淫羊藿外的其他藥材，按照制劑工藝制成干浸膏，再按“2.2.3”項下方法制備陰性對照品溶液。另取淫羊藿粉末0.5 g，按“2.2.3”項下配制原藥材溶液，備用。

圖1 UPLC色譜圖

2.2.5 系統適用性試驗 將淫羊藿苷對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液按“2.2.1”色譜條件進樣分析，由圖1可知，淫羊藿苷保留時間約在5.40 min，其色譜峰與其相鄰峰達到完全基線分離，對照品溶液與供試品溶液在相同位置有對應的色譜峰，陰性對照溶液在相應位置無干擾。

2.2.6 線性關系考察 分別將母液用甲醇稀釋成0.016、0.032、0.064、0.096、0.128、0.160 g·L－1濃度的對照品溶液，按上述色譜條件測定，以峰面積(Y)為縱坐標，以濃度(X)為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y=30 108 528.08X －94 023.65，r=0.999 9。結果表明，淫羊藿苷在 0.016 ～0.160 μg范圍內呈良好的線性關系。

2.2.7 精密度試驗 取淫羊藿苷對照品溶液重復進樣6次，按上述色譜條件測定峰面積，RSD為1.82%(n=6)，結果表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩定性試驗 取正交試驗第5組供試品溶液，分別在第0、2、4、8、12、24 h 測定峰面積，RSD 值為4.09%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

2.2.9 重復性試驗 取正交試驗第5組樣品浸膏，平行制備6份供試品溶液，按上述色譜條件測定峰面積，RSD值為1.89%(n=6)，表明該方法重復性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗 取6份已知含量的樣品，加入淫羊藿苷對照品溶液，按“2.2.3”項下方法制成溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定，計算加樣回收率。結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果(n=6)

2.3 浸膏得率的測定 將“2.1”項下9份稠浸膏置干燥箱中，70℃減壓干燥至恒重，移至干燥器中冷卻30 min，迅速稱重。計算浸膏得率，浸膏得率(%)=浸膏重量/原藥材的重量×100%。

2.4 正交試驗結果及分析 以淫羊藿苷提取率及浸膏得率為指標，考察水提工藝，正交試驗安排及結果見表3，對實驗結果進行方差分析，結果見表4。

表3 正交試驗安排L9(34)及結果考察

表4 方差分析結果

2.5 最佳工藝確定 以以淫羊藿苷提取率和浸膏得率為指標，綜合評分結果顯示，由各因素水平直觀分析的K值高低可以得出影響水提效果的因素主次為C＞A＞B，最優水平組合為A3B3C3。方差分析結果表明，因素C(提取次數)對試驗結果影響有顯著性意義(P＜0.05)，而因素 A(加水量)、B(提取時間)對試驗結果影響無顯著性意義。由于在實際生產中，從節約時間及能源，提高生產效率，以及生產的可行性等角度綜合考慮，制定最佳提取工藝為加10倍水，提取3次，每次1.0 h。

2.6 驗證試驗 按處方配比，取與正交試驗同批次的藥材共3份，分別加10倍水，提取3次，每次1.0 h。平行測定3次，經計算淫羊藿苷的提取率為(74.59 ±2.32)%，浸膏得率為(15.87 ±0.27)%。由驗證試驗結果表明優選的條件穩定、可靠、有效成分提取率較高。

3 討論

淫羊藿作為方中的君藥，其主要活性成分為淫羊藿苷，可溶于水，甲醇，乙醇等溶劑，故可以用水提法，乙醇回流法等方法提取［3－11］。本試驗為了降低成本，便于制劑大批量生產，故采用具有應用廣泛、裝置簡單的傳統水提法。

查閱相關文獻，大都采用HPLC法測含量［12－14］，本實驗首次建立了UPLC法測定淫羊藿苷提取率的方法，采用乙腈 － 水(27∶73)為流動相，較藥典［15］的梯度洗脫更節約溶劑，此方法所用時間為16 min，較藥典的55 min，大大的節省了測定時間。在保持較高的準確度和精密度的同時，提高了分離效率，減少了溶劑的損耗，縮短了測定時間，為該制劑的質量控制提供了一種更為快速準確的測定方法。

本試驗采用正交試驗，通過綜合評分法，優選出的提取工藝更具有科學性和合理性，對提取工藝的研究有著積極的指導意義，也是進行工藝篩選評價的一個可行模式。該水提工藝設計合理，可為五味溫通除痹膠囊的研制提供理論依據和試驗基礎。

［1］ 萬 磊，劉 健.名中醫劉健治療類風濕性關節炎經驗擷菁［J］.中國臨床保健雜志，2010，12(6):613 －614.

［2］ 姜 輝，劉 健，高家榮，等.五味溫通除痹膠囊對類風濕關節炎風寒濕痹阻證模型大鼠的治療作用［J］.風濕病與關節炎，2012，1(6):23 －27.

［3］ 唐勇琛，梁學政，陳惠紅，等.正交試驗優選五子補腎膠囊水提醇沉工藝［J］.中國醫院藥學雜志，2013，33(23):2002－2004.

［4］ 胡 媛，汪洪湖，陳文婕，等.乳增寧膠囊的制備工藝研究［J］.蚌埠醫學院學報，2013，10(5):17 －19.

［5］ 杜志謙，牛瓊瓊，夏華玲，等.骨松強骨顆粒的醇提取工藝研究［J］.世界中醫藥，2013，8(11):1348 －1350.

［6］ 姚慧娟，胡道德，顧 磊，等.反相高效液相色譜法測定淫羊藿中淫羊藿苷的含量［J］.中國臨床藥學雜志，2010，19(1):36－38.

［7］ 謝 燕，李建利，施明毅，等.正交試驗優選軟脈通瘀顆粒的水提工藝［J］.中國醫藥指南，2013，11(12):466，483.

［8］ 杜天信，殷 娜，杜志謙，等.骨松健骨顆粒的提取工藝優選［J］.中國實驗方劑學雜志，2013，19(17):50 －52.

［9］ 施明毅，李建利，謝 燕，等.正交試驗優選選冠心康膠囊的水提工藝條件［J］.成都中醫藥大學學報，2013，36(1):55－93.

［10］ 朱裕林，張冬梅，王 雷，等.骨疏靈顆粒提取工藝優化［J］.安徽醫藥，2013，17(6):909 －911.

［11］ 涂興明，李賜恩，吳康郁，等.HPLC法測定骨康口服液中淫羊藿苷的含量［J］.中藥新藥與臨床藥理，2013，24(6):613－615.

［12］ 顧玉英，汪 怡，尤奮強，等.HPLC法測定定痛寧沖劑中阿魏酸的含量［J］.安徽醫藥，2013，17(11)1873－1874.

［13］ 袁天榮，趙雪梅.HPLC測定芪參顆粒中丹參酮ⅡA的含量［J］.安徽醫藥，2013，17(11):1875 －1876.

［14］ 周憶新.高效液相色譜法測定三子強腎膠囊中的淫羊藿苷含量［J］.安徽醫藥，2012，16(3):306 －308.

［15］ 國家藥典委員會.中國藥典(一部)［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:306－308.