細菌內毒素檢查法在水膠體敷料臨床使用安全性評價中的應用

2014-12-13 06:16:24許雷鳴堵偉鋒林園園安徽省食品藥品檢驗研究院安徽合肥005皖南醫學院安徽蕪湖4000解放軍第74醫院福建廈門600

安徽醫藥 2014年10期

許雷鳴，顧倩，武谷，堵偉鋒，李翔，林園園(.安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽合肥 005;.皖南醫學院，安徽蕪湖 4000;.解放軍第74醫院，福建廈門 600)

水膠體敷料是在濕性愈合原理指導下發展起來的一類新型傷口敷料，由親水性高分子顆粒與橡膠彈性體混合加工而成，集吸收性、對無創皮膚的黏性、隔離細菌等作用于一身，可應用于多種不同傷口的治療，特別是對于慢性難愈性傷口具有顯著療效［1－2］。本試驗根據《中國藥典》2010年版二部“細菌內毒素檢查法”［3］和 GB/T14233.2—2005 中的細菌內毒素試驗［4］，以及相關細菌內毒素檢查的文獻［5－20］，對水膠體敷料應用鱟試劑進行細菌內毒素檢查的可行性進行了研究，建立了水膠體敷料的細菌內毒素檢查方法并采用凝膠半定量試驗測定產品中的細菌內毒素含量，為評價臨床應用水膠體敷料的安全性提供依據。

1 儀器與試藥

VS-1300L-U潔凈工作臺(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司)，S648恒溫水浴鍋(上海醫療器械七廠)，MS3 digital混旋儀(IKA)，微量取液器(50～250 μL，上海榮泰生化工程有限公司)，細菌內毒素檢查用具(湛江博康海洋生物有限公司)。試驗所用玻璃儀器均經250℃干烤2 h。

水膠體敷料3批(合肥某公司生產，批號為130220、121225、120510，規格:10 cm ×10 cm)。

鱟試劑(湛江安度斯生物有限公司，批號:1209101，靈敏度:0.125 EU·mL－1，規格:每支 0.1 mL。湛江博康海洋生物有限公司，批號:1201052，靈敏度:0.125 EU·mL－1，規格:每支 0.1 mL。湛江安度斯生物有限公司，批號:1210162，靈敏度:0.03 EU·mL－1，規格:每支0.1 mL)。

細菌內毒素工作標準品(凍干品)(中國食品藥品檢定研究院，效價:每支100 EU，批號:150601－201176)。細菌內毒素檢查用水(福州新北生化工業有限公司，批號:13012115，規格:每瓶50 mL)。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液制備方法的確立每片水膠體敷料表面積計為200 cm2，按水膠體敷料表面積每1 cm2加入4 mL細菌內毒素檢查用水，37℃保溫浸提2 h，為均一透明的溶液，可作為供試品溶液用于正式試驗。

2.2 鱟試劑靈敏度復核試驗按《中國藥典》2010年版二部附錄細菌內毒素檢查法對兩個廠家的鱟試劑進行靈敏度復核試驗，結果見表1。由結果可知，2 λ 管均為陽性，0.25 λ 管和陰性對照管均為陰性，兩個不同廠家的3批鱟試劑靈敏度測定值均在0.5～2.0 λ范圍內，符合要求，可用于細菌內毒素檢查，并以標示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。

表1 鱟試劑靈敏度復核試驗結果

2.3 內毒素限值(L)的確定水膠體敷料的通常臨床用量為每次1片(每片表面積為200 cm2)，根據公式 L=K/M，注射劑 K=5 EU·kg－1·h－1，式中M為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量，人均體重按 60 kg計算，則水膠體敷料 L=1.5 EU·cm－2。同時考慮安全系數為3的情況下，最終確定限值(L)為 1/3 ×1.5 EU·cm－2=0.5 EU·cm－2。

2.4 干擾試驗預試驗目前市售鱟試劑λ通常在0.5 ～0.03 EU·mL－1，根據公式 MVD=cL/λ，式中L為供試品的細菌內毒素限值，c為供試品溶液的濃度，λ為鱟試劑的標示靈敏度，則水膠體敷料供試品溶液對應的最大有效稀釋倍數分別為1、2、4倍。取水膠體敷料樣品一批(批號:130220)，將水膠體敷料浸提液用細菌內毒素檢查用水分別配制成為1、2、4倍稀釋液，將此系列溶液記為NPC。同法制備上述系列溶液，向其中加入內毒素標準溶液，使每一濃度的溶液中均含有2 λ濃度的細菌內毒素，此系列溶液記為PPC。取湛江安度斯生物有限公司和湛江博康海洋生物有限公司生產的靈敏度均為0.125 EU·mL－1鱟試劑，分別與上述NPC和 PPC進行反應，每一濃度重復做2管，同時設陽性對照(PC)和陰性對照(NC)，干擾預試驗結果見表2。預試驗結果表明，本試驗條件下制備的水膠體敷料供試品溶液可能對細菌內毒素檢查無干擾作用。

表2 水膠體敷料供試品溶液干擾試驗預試結果

2.5 干擾試驗為了最終確認是否存在干擾因素的影響，取“2.1”項下水膠體敷料樣品(批號:130220)制備的供試品溶液一批，按《中國藥典》2010年版二部附錄ⅪE“細菌內毒素檢查法”凝膠法干擾試驗項進行正式干擾試驗，結果見表3。正式干擾試驗結果表明，采用湛江安度斯生物有限公司和湛江博康海洋生物有限公司生產的靈敏度均為0.125 EU·mL－1的鱟試劑進行試驗，Es均在0.5～2.0 λ 內且 Et/Es均在 0.5 ～2.0 λ 之間，確認水膠體敷料供試品溶液對細菌內毒素檢查無干擾。

2.6 質量標準起草取本品適量，以水膠體敷料表面積每1 cm2加入4 mL細菌內毒素檢查用水的比例，37 ℃保溫浸提 2 h，按 GB/T14233.2—2005中的細菌內毒素試驗進行，每1 cm2中含內毒素的量應小于0.5 EU。

表3 水膠體敷料供試品溶液的干擾試驗結果

2.7 樣品細菌內毒素檢查根據“2.5”項下結果，取3批樣品，分別用兩個不同廠家靈敏度為0.125 EU·mL－1的鱟試劑按本試驗起草的標準和《中國藥典》2010年版二部附錄ⅪE“細菌內毒素檢查法”凝膠限度試驗對樣品進行細菌內毒素檢查，結果見表4。結果表明3批樣品的細菌內毒素檢查結果均符合起草的質量標準要求。

表4 水膠體敷料樣品細菌內毒素檢查結果

2.8 樣品細菌內毒素的凝膠半定量檢測用靈敏度為0.03 EU·mL－1的鱟試劑對水膠體敷料供試品溶液作細菌內毒素檢查，則最大有效稀釋倍數為4。用細菌內毒素檢查用水將3批供試品溶液分別作1、2、4倍稀釋(NPC)，按《中國藥典》2010年版二部附錄的凝膠半定量試驗進行，同時制備供試品陽性對照PPC(添加內毒素使其含外加內毒素為0.06 EU·mL－1)。分別取上述溶液0.1 mL，加到預先加有0.1 mL鱟試劑的反應管內，每個濃度做2管，混合均勻，同時設陽性對照和陰性對照，結果見表5。結果表明，3批樣品的細菌內毒素含量均在每片25～50 EU之間。

3 討論

隨著對傷口愈合認識的深入，薄膜類、泡沫類、水凝膠類、水膠體類、藻酸鹽類、藥用類等一系列醫用新型敷料不斷涌現。2000年8月美國食品藥品管理局(FDA)在新頒布的創面醫療用品(外用藥和敷料)行業指南中特別強調，保持創面的濕潤環境是標準的處理方法，新型密閉性敷料逐漸成為醫用敷料發展的主流。水膠體敷料由水狀膠粘劑、覆蓋層薄膜和粘結劑組成，主要用于慢性傷口(如壓瘡)和靜脈潰瘍傷口的治療，也可用于急性傷口的護理并且還是一種適用于兒童使用的理想敷料。本文對水膠體敷料應用鱟試劑進行細菌內毒素檢查的可行性進行了研究，以期采用細菌內毒素檢查法控制本品的致熱物質。

供試品溶液的制備是本試驗的一個重要環節。供試品浸提時間不得少于1 h，但浸提時間過長，浸提液會變得黏稠，干擾凝膠法測定。浸提時間定為2 h較為合適。每片水膠體敷料表面積為200 cm2，經預試驗發現，按水膠體敷料表面積每1 cm2加入2 mL細菌內毒素檢查用水，37℃保溫浸提2 h，有輕微渾濁現象。按水膠體敷料表面積每1 cm2加入4 mL細菌內毒素檢查用水，37℃保溫浸提2 h，則為均一透明的溶液。

根據《中國藥典》2010年版二部附錄ⅪE“細菌內毒素檢查法”和GB/T14233.2—2005中的細菌內毒素試驗以及水膠體敷料的臨床實際應用情況，確定該品種細菌內毒素檢查限值為0.5 EU·cm－2。由于細菌內毒素檢查法限值計算采用的是每小時最大可接受的靜脈注射內毒素劑量，而本品臨床使用途徑為體表小傷口的覆蓋，其限值不如靜脈注射劑要求嚴格，并同時考慮到安全系數為3，因此采用0.5 EU·cm－2作為本品細菌內毒素檢查限值是可以保證臨床使用安全的。不同廠家的鱟試劑在工藝、質量等方面有一定差異，其抗干擾能力也存在差異，通過采用2個不同廠家的鱟試劑進行試驗，可客觀地評價供試品溶液對鱟試劑與內毒素發生凝集反應的干擾程度。經干擾試驗確證，在本實驗條件下，水膠體敷料浸提液(按水膠體敷料表面積每1 cm2加入4 mL細菌內毒素檢查用水，37℃保溫2 h)對細菌內毒素檢查無干擾作用，可選擇靈敏度為0.125 EU·mL－1及以上的鱟試劑對本品進行細菌內毒素檢查。按擬定標準檢驗，本品3批樣品的細菌內毒素檢查結果均符合起草的質量標準要求，凝膠半定量試驗結果表明3批樣品的細菌內毒素含量均在每片25～50 EU之間，用細菌內毒素檢查法來檢測該產品中的致熱原是可行的。