HPV E6/E7 mRNA檢測與宮頸病變發展的相關性研究

江偉敏，姚余有

(1.安徽醫科大學公共衛生學院，安徽合肥 230032;2.安徽省阜陽職業技術學院，安徽阜陽 236000)

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染是宮頸上皮內瘤樣病變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)和宮頸癌的主要致病原因［1］。研究表明高危型HPV的E6/E7是病毒致癌基因，其產物可抑制抑癌基因p53及視網膜母細胞瘤蛋白(pRb)，促進細胞無規則生長，參與宮頸癌的發生［2］，但有關宮頸組織標本病理分級與HPV E6/E7 mRNA表達之間的關系研究較少。本研究擬利用安徽省阜陽市某三級甲等醫院婦科病人采用先進的支鏈 DNA(bDNA)技術，研究宮頸組織標本病理分級與HPV E6/E7 mRNA表達之間的關系，為早期干預宮頸疾病提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 對象 對象為2012年9至2013年11月安徽省阜陽市人民醫院婦科門診病例，經宮頸液基細胞學檢查不能確診同時懷疑宮頸病變的女性患者，行陰道鏡檢測，并進行宮頸組織活檢，一部分活檢組織進行病理診斷，一部分凍存于液氮中，用于RNA的提取。

1.2 材料 組織裂解劑(溶解液與蛋白酶 K按1∶800混合)、檢測探針和反應液均購自Diacarta公司;96孔HPV E6/E7 mRNA檢測板購自河南科蒂亞(新鄉)生物技術有限公司。檢測使用的冷光儀為QuantiVirusTM冷光儀(Diacarta)。

1.3 宮頸細胞病理學診斷 宮頸組織取材包括陰道鏡直接活檢，定點四象限活檢和子宮頸管刮取活檢。取材后用10%中性甲醛固定16～24 h，然后將標本放入70%酒精中保存，石蠟包埋、切片，常規HE染色，常規封片，根據病理診斷標準閱片。將組織標本分為宮頸炎、輕度宮頸上皮內瘤變(CINⅠ)、中度宮頸上皮內瘤變(CINⅡ)、重度宮頸上皮內瘤變(CINⅢ)和宮頸癌。

1.4 HPV E6/E7 mRNA檢測 活檢組織粉碎后加入裂解劑，65℃ 水浴30 min，得到裂解液。按說明書配置相關溶液并進行操作，經過信號放大、加入標記熒光物質的底物后，在QuantiVirusTM冷光儀上檢測。陽性對照、空白對照均為復孔，所有標本均檢測兩次取均值［3］。

1.5 統計學方法 采用SPSS 13.0軟件對所有數據進行統計。不同程度宮頸病變中HPV E6/E7 mRNA的表達率比較采用χ2檢驗/Fisher精確檢驗;不同病理分級宮頸組織標本HPV E6/E7 mRNA的表達量差異采用成組設計多個樣本比較的秩和檢驗(Kruskal-Wallis法);宮頸組織標本病理分級與HPV E6/E7 mRNA表達量的相關性研究采用秩相關分析。檢驗水準為P＜0.05。

2 結果

2.1 病理診斷結果 在檢測的226例宮頸組織中，宮頸炎153例，CINⅠ22例，CINⅡ15例，CINⅢ17例，宮頸癌19例。

2.2 不同病理分級的宮頸組織標本HPV E6/E7 mRNA的表達率 226例宮頸組織標本中，檢測出HPV E6/E7 mRNA陽性標本 56例，陽性率 24.8%。其中宮頸炎組 9例(5.9%)，CINⅠ組12 例(54.5%)，CINⅡ組10 例(66.7%)，CINⅢ組12例(70.6%)，宮頸癌組13例(68.4%)(表1)。χ2檢驗顯示，各組間差異有顯著性。進一步的χ2分割檢驗顯示，宮頸炎組HPV E6/E7 mRNA陽性表達率顯著低于CIN組及宮頸癌組(P＜0.01);而CIN組之間、CIN與宮頸癌組之間的HPV E6/E7 mRNA陽性表達率差異無統計學意義。

表1 不同病理分級的宮頸組織標本HPV E6/E7 mRNA的表達陽性率

2.3 不同病理分級的宮頸組織標本HPV E6/E7 mRNA表達量 為了了解HPV E6/E7 mRNA表達量(copies/ml)與宮頸組織病理分級是否存在相關，我們采用冷光儀對HPV E6/E7 mRNA表達量進行檢測，結果見表2。多組秩和檢驗結果顯示，不同病理分級的宮頸組織標本HPV E6/E7 mRNA表達量差異有顯著性(H=111.362，P＜0.01)。秩相關分析顯示，宮頸組織標本病理分級與HPV E6/E7 mRNA表達量成正相關(rs=0.7，P ＜0.01)。

表2 不同病理分級的宮頸組織標本HPV E6/E7 mRNA的表達量

3 討論

HPV感染后可在體內長期處于潛伏狀態，在出現機體免疫力降低等誘發因素時，潛伏的HPV可恢復增殖。研究發現，HPV的感染過程通常可分為潛伏感染期、亞臨床感染期、臨床癥狀期和HPV相關的腫瘤期，并且99.7%的宮頸癌患者均具有HPV的感染［4－5］。CIN是與宮頸浸潤癌密切相關的一組癌前病變，反映了宮頸癌發生發展的連續過程，HPV感染是CIN發生的重要原因，也是CIN進展為宮頸癌的重要誘因［6］。

HPV基因組學研究顯示，HPV編碼包括6個早期開放讀碼框(E1，E2，E4，E5，E6 和 E7)及 2 個晚期讀碼框(L1 和L2)。HPV感染后首先潛伏于基底細胞層，其DNA可作為獨立的外源染色體進入細胞核內，整合至正常細胞的基因組當中，并且利用細胞的轉錄翻譯機制表達了兩種有害的病毒蛋白E6和E7蛋白。這兩種蛋白都能夠與兩種非常重要的抑癌蛋白p53蛋白和pRb蛋白結合，減低這兩種抑癌蛋白的活性。p53蛋白能夠在細胞DNA出現損傷時抑制細胞繼續分裂，啟動DNA修復機制對損傷進行修復，或者直接促使細胞凋亡。但在p53蛋白活性減低后，極大的增加了細胞出現突變的風險。pRb蛋白能夠抑制細胞過度生長，在活性減低后，細胞的增殖將會失控［7－8］。

目前廣泛應用的HPV DNA檢測是病因學檢測，無法體現宮頸細胞內HPV病毒載量、病毒整合程度，也無法明確HPV的致癌基因是否發揮作用［9］。在宿主細胞中，無論HPV處于游離狀態或整合狀態，致癌基因E6和E7要發揮作用，必須進行mRNA的轉錄。因此，E6/E7 mRNA的檢測可用于評價宮頸細胞的異常轉化［10－11］。

bDNA技術是一種新型的核酸雜交方法，在我國僅較少實驗室從美國引進，該方法采用bDNA分子放大捕獲的目標DNA/RNA信號，因此無需PCR擴增過程，放大倍數精確，重復性、穩定性高，可以準確定量檢測DNA/RNA。與常規實時PCR技術相比，bDNA技術無需抽提純化DNA/RNA，無需反轉錄和PCR擴增，只要將樣本用特定裂解液裂解后，經探針雜交與信號放大即可快速得到準確的檢測結果［12］。

本研究采用bDNA技術檢測了宮頸炎、CIN和宮頸癌患者宮頸組織中HPV E6/E7 mRNA的表達，在不同病理級別的患者中均發現了陽性表達。統計表明，宮頸炎組的陽性表達率顯著低于CIN組及宮頸癌組;在CIN和宮頸癌中，隨著細胞學病變程度的增高，陽性表達率出現了上升趨勢。HPV E6/E7 mRNA表達量的檢測結果表明，不同病理分級的宮頸組織標本HPV E6/E7 mRNA表達量差異有顯著性，宮頸組織標本病理分級與HPV E6/E7 mRNA表達量成正相關。提示，HPV E6/E7 mRNA是宮頸細胞癌變的重要因素。因此，對HPV E6/E7 mRNA表達量的定量檢測，對于及時干預宮頸病變的發展、協助臨床診斷、宮頸癌的分型及預后均具有重要的指導意義。

［1］ 崔燕紅，宛傳丹，趙一琳，等.常熟地區女性HPV感染及亞型分布調查研究［J］.安徽醫藥，2014，18(1):81 －83.

［2］ Fiks AG，Grundmeier RW，Mayne S，et al.Effectiveness of decision support for families，clinicians，or both on HPV vaccine receipt［J］.Pediatrics，2013，131(6):1114 －1124.

［3］ 王 華，陳亞寶，葉麗華，等.應用支鏈DNA技術檢測人乳頭瘤病毒E6/E7mRNA在宮頸疾病篩查中的價值［J］.中華臨床醫師雜志，2011，5(15):4362 －4366.

［4］ Castle PE，Shaber R，LaMere BJ，et al.Human papillomavirus(HPV)genotypes in women with cervical precancer and cancer at Kaiser Permanente Northern California［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2011，20(5):946 －953.

［5］ Ogilvie GS，Krajden M，van Niekerk DJ，et al.Primary cervical cancer screening with HPV testing compared with liquid－based cytology:results of round 1 of a randomised controlled trial－the HPV FOCAL study［J］.Br J Cancer，2012，107(12):1917 －1924.

［6］ 賈政軍，周玉春，胡 蓉，等.HPV mRNA實時熒光定量 PCR檢測及其與宮頸癌發生的關系［J］.實用預防醫學，2012，19(3):354－358.

［7］ Keller MJ，Burk RD，Xie X，et al.Risk of cervical precancer and cancer among HIV－infected women with normal cervical cytology and no evidence of oncogenic HPV infection ［J］.JAMA，2012，308(4):362－369.

［8］ Xi LF，Schiffman M，Koutsky LA，et al.Association of human papillomavirus type 31 variants with risk of cervical intraepithelial neoplasia grades 2 － 3 ［J］.Int J Cancer，2012，131(10):2300 －2307.

［9］ 林 華.宮頸細胞學檢查為不典型鱗狀上皮細胞136例臨床分析［J］.安徽醫藥，2011，15(12):1562 －1563.

［10］ Vieira L，Almeida A.The cytology and DNA detection by the PapilloCheckRtest in the diagnosis of human papillomavirus infection［J］.Eur J Microbiol Immunol(Bp)，2013，3(1):61 －67.

［11］ Broccolo F，Fusetti L，Rosini S，et al.Comparison of oncogenic HPV type－specific viral DNA load and E6/E7 mRNA detection in cervical samples:results from a multicenter study ［J］.J Med Virol，2013，85(3):472 －482.

［12］ Shen Y，Gong J，He Y，et al.QuantivirusRHPV E6/E7 RNA 3.0 assay(bDNA)is as sensitive，but less specific than Hybrid Capture 2 test［J］.J Virol Methods，2013，187(2):288 －293.