免疫學標記在細針穿吸甲狀腺橋本病診斷中的應用

劉邦榮，陸 軍，張 偉，蔣 艷，張 巖，陳媛媛

(安徽省淮北市人民醫院，安徽淮北 235000)

橋本氏甲狀腺炎(Hashimot's thyroiditis，HT)是一種自身免疫性疾病，可伴發甲狀腺癌，近年來有逐年上升趨勢。甲狀腺細針穿刺細胞學(FNAC)檢查由于簡單、快速、痛苦小，已成為診斷HT重要依據。據Doniach標準［1］將橋本甲狀腺炎按細胞學特點分為三個亞型即淋巴細胞型(lymphocytic subtype，LC)、嗜酸細胞型［oxyphil(cytology)subtype，OC］和纖維化型(fibrous subtype，FC)。橋本病顯微鏡下最顯著的特點是大量淋巴細胞浸潤。但是在工作中觀察到HT和結節性甲狀腺腫，在涂片中均能見到成小簇狀或三、五個密集排列細胞，核小、圓形或橢圓、或深染裸核較多見，是甲狀腺上皮，還是聚集地淋巴細胞，形態上往往難以區分［2］;而甲狀腺濾泡上皮細胞乳頭狀增生和乳頭狀癌(PTC)的區別［3］，細胞學診斷也有難度。因此，本研究采用細胞涂片加做免疫細胞化學方法檢測CD45RO、Vimentin、HLA-DR、CK/Pan的表達，探討其在橋本病中的表達，為細胞病理學鑒別診斷提供依據。

1 對象和方法

1.1 研究對象 2009年1月至2011年12月我院內分泌科門診及住院患者，經FNAC證實細胞學類型僅為橋本甲狀腺炎共60例，男3例，女57例，年齡10～77歲。依據細胞學特點分淋巴細胞型23例，嗜酸細胞型29例，纖維化型8例。其中橋本病伴細胞不典型增生17例，橋本伴惡性病變3例。結節性甲狀腺腫對照10例，均從術后結節性甲狀腺腫組織中針吸;甲狀腺乳頭狀癌對照5例，均從術后病理組織中針吸獲取。全部病例均通過以下方式進一步確診。(1)甲狀腺術后病理;(2)自身抗體測定陽性;(3)依據穿刺細胞學診斷并經相應的治療后好轉。未手術病例隨訪3年以上。

1.2 方法 首先要仔細觸診甲狀腺，確定具體穿刺部位和進針方向。患者取坐姿，局部用碘伏消毒，不必麻醉。持5 mL注射器接7號針頭，將針經皮膚快速刺入甲狀腺或結節內，然后在不同方向快速來回穿刺，待針座有成分時迅速拔出針頭，將抽吸物打在載玻片上，均勻涂開。待干后以95%酒精固定，HE及瑞氏染色。第二次將抽吸物注射到液基保存液中。離心沉淀后涂片備用。

選取甲狀腺細針抽吸標本未染的涂片，采用SABC二步法，進行免疫細胞染色，并做陽性對照。所用CD45RO、Vimentin、HLA-DR、CK/Pan，SP試劑盒購置北京中杉金橋生物技術有限公司。

免疫細胞化學判定:以細胞內或細胞膜上出現棕黃色顆粒且染色強度高于背景的非特異性著色為陽性。按陽性細胞所占百分數并參考著色強度確定分級如下:將染色結果分為5個等級，無陽性細胞 (－);陽性細胞率5% ～25%(+);陽性細胞率26% ～50%(++);陽性細胞率51% ～75%(+++);陽性細胞數＞75%(++++)。

1.3 統計學分析 采用SPSS13.0統計分析軟件進行分析，計數資料用例數、百分數描述，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

10～29 歲共26人占43.3%，年輕人呈高發趨勢，見表1。

表1 60例橋本病不同的年齡分布及百分比

CD45RO、HLA-DR和Vimentin在60例HT和結節性甲狀腺腫細胞中的陽性表達情況見表2、圖1。

表2 CD45RO、HLA-DR和Vimentin在HT和結節性甲狀腺腫細胞中的陽性表達情況

圖1 CD45RO;Vimentin;HLA-DR;CK/Pan的表達情況

CK/Pan在橋本組60例中，共13例表達，陽性率占21.7%。其中細胞學診斷橋本病伴細胞不典型增生17例中，++以上陽性10例(10/17)，診斷惡性病變3例均強陽性(3/3)與術后組織病理一致，17例患者中6例術后診斷惡性，共9例占本組腫瘤發病率的15.0%(9/60)，對照組中5例均強陽性表達(5/5)詳見圖1。

3 討論

Welliams和Daniach統計40歲以上女性多見，但在本組中統計，20歲以下8例，10～29歲26例占43.3%，年輕人呈高發趨勢［4］。女性53例，占95%。因此，其發生病因可能與雌激素有關。雌激素可影響B淋巴細胞的抗原受體組合。動物實驗發現，雄激素可抑制甲狀腺球蛋白接種后甲狀腺炎的發生，而雌激素則有促進作用［5］。

3.1 CD45RO在HT中的表達 HT是一種以T細胞為介導的甲狀腺自身免疫性疾病，在細胞學診斷中淋巴細胞型和嗜酸細胞型均可見大量淋巴細胞。淋巴細胞型中CD45RO標記的淋巴細胞單抗陽性細胞++以上僅4例(4/23);嗜酸細胞型++以上24例(24/29);纖維化型中1例(1/8)。結節性甲狀腺腫++以上未見表達。CD45RO用來標記抗原致敏過的淋巴細胞和記憶T細胞，只有活化和記憶T細胞才能在免疫損傷中發揮其作用。病變組織中浸潤的淋巴細胞未必都發生作用，因為淋巴細胞對抗原的識別是特異性的。薛婧報道［6］，CD45RO有11個 N-糖基化位點，由于糖基化位點的缺失，這種自我保護的機能被破壞導致甲狀腺自身免疫的損傷。10例結節性甲狀腺腫中，CD45RO表達呈+表達2例，但是，未見++以上表達。

3.2 HLA-DR在HT中的表達 HLA(人類白細胞抗原)Ⅱ類抗原中，是最復雜的遺傳多態性系統。1989年郁忠勤報道DR與 HT病呈正相關［7］。正常人甲狀腺濾泡上皮(TEC)不表達HLA-DR抗原，而在HT患者甲狀腺組織內，可見到TEC不同程度地表達HLA-DR抗原，因為DR抗原在免疫應答上具有抗原提呈，激活T淋巴細胞的作用，因此，在HT的免疫損傷中起了很重要的作用。在涂片中，淋巴細胞和甲狀腺濾泡上皮細胞均有表達，DR表達的陽性++以上嗜酸細胞型21例(21/29)，纖維化型4例(4/8)，淋巴細胞型++2例(2/23)。通過DR在甲狀腺上皮的抗原異常表達程度，判斷自身免疫性甲狀腺疾病的診斷及病情發展狀況。

3.3 Vimentin波形蛋白的表達 波形蛋白是一種中間絲蛋白，通常認為在間葉組織細胞中表達，上皮來源細胞一般不表達，故被認為是一種間葉成分特異性標記物。在本組中，Vimentin表達的陽性程度上++以上嗜酸細胞型10例(10/29)，纖維化型中8例(8/8)，淋巴細胞型++以上均未見表達。通過年齡組發現在20歲以下的病例中未見表達。而在30歲以上患者中均不同程度的陽性表達。Vimentin反應HT在疾病的進展中，由于自身免疫的破壞使甲狀腺濾泡上皮細胞不斷出現損傷而引起纖維組織增生［8］。

3.4 CK/Pan的表達 甲狀腺乳頭狀癌占甲狀腺癌的75%以上。CK/Pan是廣譜的細胞角蛋白抗體，是有低分子量AE1和高分子量AE3組成。單克隆抗體AE1能識別酸性家族的細胞角蛋白10、14、15、16和19;AE3單抗能與整個堿性家族的細胞角蛋白起反應。主要定位以細胞膜為主，少量胞漿顯色。本組17例橋本伴不典型增生中，++以上陽性10例、，其中6例術后是乳頭狀癌。細胞學確診3例甲狀腺癌，CK/Pan表達強陽性與術后病理一致。HT病變中濾泡上皮細胞的增生與結節性甲狀腺腫的濾泡上皮細胞增生性質不同，屬于不典型增生，與HT引起的免疫損傷和甲狀腺功能減退繼發TSH過度分泌對濾泡上皮細胞的持續刺激有關［9－10］。提示 HT 存在癌高發危險［11－12］。其中1 例患者女25歲，涂片中甲狀腺濾泡上皮乳頭狀增生，細胞異型不明顯，CK/Pan強陽性，手術后組織學確診為甲狀腺乳頭狀癌。對照組病例中1例有弱表達。因此，認為細針穿刺細胞學檢查加做CK/Pan，為臨床診治患者提供新的依據。

綜上所述，甲狀腺細針穿刺細胞學檢查結合免疫細胞化學染色對診斷甲狀腺疾病提供新的思路。可有助于HT的分型及與其他甲狀腺疾病的鑒別，判斷疾病的發展程度。減少良性病變患者避免不必要的手術［13］。但是，由于甲狀腺血管豐富穿刺細胞數少，有效的細胞不能在涂片的固定位置。細胞容易掉片造成染色失敗。本組是將穿刺細胞放入液基保存液中，離心后可多制片，當遇到掉片時可有涂片補充。另外，固定要及時，涂片做免疫標記時以當天效果最佳，盡量3 d內完成。否則，容易細胞陽性模糊定位不準。在操作時每一步延長5 min效果較好。免疫細胞技術為細針穿刺細胞學發展帶來更廣闊的前景。

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