漿膜腔積液細胞學(xué)診斷中傳統(tǒng)涂片法和細胞塊法的應(yīng)用價值比較

劉 艷，郝大海

(安徽省阜陽市腫瘤醫(yī)院病理科，安徽阜陽 236018)

漿膜腔積液標本是病理科或細胞學(xué)實驗室的常規(guī)送檢標本，也是分析、診斷疾病的重要依據(jù)。常規(guī)離心涂片檢查以其簡單，快速，費用低等特點已成為臨床診斷良惡性積液常用及重要的方法。近年來細胞塊法也不斷被應(yīng)用于日常工作中。為了比較傳統(tǒng)涂片法同細胞塊法的優(yōu)劣，我們收集了165例漿膜腔積液，涂片同時制作細胞塊，必要時輔以免疫組化染色，進行診斷。

1 資料與方法

1.1 資料 收集我科2011年1月—2013年7月漿膜腔積液2100例，經(jīng)確診病例165例，不確定病例及未能做細胞塊者未列入此組，在涂片同時制作細胞塊做石蠟切片。該組病例男性70例，女性95例，年齡21～87歲，胸水87例，腹水69例，其他部位穿刺液9例。

1.2 試劑 所用甲醛及95%乙醇均為分析純，免疫組化試劑購自福州邁新生物技術(shù)有限公司，抗體和試劑均為即用型S-P試劑盒及酶底物顯色劑DAB試劑盒，按說明書的實驗步驟操作。

1.3 方法 送檢積液標本一般約500 mL左右，將標本室溫靜置30 min，輕輕棄去上清液，留取50～100 mL下層液體，如為血性保本，可以在下層液體加入10%福爾馬林300 mL左右，搖勻后使紅細胞溶解破壞，室溫再靜置30 min，棄去上清液，同樣留取下層液體，如紅細胞過多，可反復(fù)2～3次，使紅細胞全部破壞，然后取下層沉淀物兩管配平2 000 r·min－1，離心5 min，輕輕取出離心管，棄去上清液，其中一管沉渣用棉簽沾取涂片2張，另一管加95%酒精3～5 mL搖勻后，2 000 r·min－1，離心 5 min，取沉渣用濾紙包好，10%福爾馬林固定，常規(guī)脫水，包埋，切片及染色，光鏡觀察診斷，必要時進一步做免疫組化染色標記。

1.4 判斷標準 (1)傳統(tǒng)涂片法:涂片法鏡下肯定惡性特征的細胞定為惡性(陽性)，再根據(jù)細胞形態(tài)進行傾向性分型。細胞有惡性特征，但證據(jù)不足，定為疑癌細胞(陽性);細胞有異型，但與增生的間皮無法鑒別定為異型細胞(陰性);未見惡性細胞或異型細胞定為陰性。(2)細胞塊:細胞塊法切片鏡下有惡性細胞，具有腺性特征診斷為腺癌，具有鱗狀細胞特征者診斷為鱗癌;不能分型者免疫組化染色進一步鑒別。(3)免疫組化:免疫組化染色是10%以上的靶細胞出現(xiàn)定位清晰的棕褐/黃色顆粒為陽性表達(按抗體說明書上的有效著色部位)，目標靶細胞完全不著色為陰性，介于二者之間為弱陽性(不確定表達)。(4)臨床確診(綜合診斷):臨床及影像學(xué)+病理診斷為惡性或臨床及影像學(xué)+腫瘤標志物+涂片或切片見到惡性腫瘤細胞為陽性病例;涂片或切片均未見惡性腫瘤細胞+積液臨床檢驗及治療反應(yīng)均提示非腫瘤性積液為陰性病例。

1.5 統(tǒng)計分析 兩種方法檢測結(jié)果同臨床確診的符合情況分析:采用配對設(shè)計定性資料的McNemar χ2檢驗，檢驗水準α 取0.05。

2 結(jié)果

165例漿膜腔積液傳統(tǒng)涂片法與細胞塊法良惡性分類具體結(jié)果見表1所示。8例兩種方法均未能分型，后經(jīng)免疫組化分型確診為，低分化腺癌4例，鱗癌1例，淋巴瘤1例，精原細胞瘤1例，未確定1例。表2顯示傳統(tǒng)涂片法、細胞塊法檢測結(jié)果及臨床確診情況。傳統(tǒng)涂片法的診斷敏感性、特異性及準確率分別為84.5%、90.3%及86.7%，而細胞塊法的診斷敏感性、特異性及準確率分別為89.3%、100%及93.3%。表3顯示兩種方法同臨床確診的符合情況，兩種方法檢測結(jié)果之間的差別有統(tǒng)計學(xué)意義，細胞塊法優(yōu)于傳統(tǒng)涂片法。

表1 傳統(tǒng)涂片法及細胞塊法檢測結(jié)果

癌細胞胞體及胞核較大，明顯異型，多形性，染色質(zhì)較粗，深染，呈團狀，條索狀排列，與間皮細胞及淋巴細胞相比具有另類的特征，腺癌細胞常成團或散在分布，細胞圓形或橢圓形，核大畸形深染，核漿比例高，核仁明顯，易見胞漿空泡，排列成梅花狀，腺腔樣，乳頭狀等(圖1);而鱗狀細胞癌在積液中常散在或小簇分布，圓形，梭形或不規(guī)則形，核染色質(zhì)深，似碳墨狀，有時可見細胞間橋及角化(圖4);腺癌的惡性細胞在細胞塊中排列成腺管狀，乳頭狀等腺樣結(jié)構(gòu)(圖2，3)，鱗癌細胞排列成片狀，可見明顯細胞間橋或角化的鱗狀細胞特征(圖5);但是，一些乳腺浸潤性導(dǎo)管癌細胞在胸水中是成團分布，在細胞塊中可類似鱗狀細胞癌的排列(圖6)，但仔細辨認，可以發(fā)現(xiàn)浸潤性導(dǎo)管癌在細胞塊中是一圈一圈的規(guī)則排列，并沒有鱗狀細胞癌的細胞間橋，另外鱗狀細胞癌一般表達高分子量CK，而乳腺癌往往表達低分子量CK，ER，PR ，C-ERB-b2等。

表2 傳統(tǒng)涂片法、細胞塊法檢測結(jié)果及臨床確診情況(二分類)

表3 傳統(tǒng)涂片法、細胞塊法與臨床確診的符合情況

注:圖1，細胞涂片顯示腺癌細胞成團分布，立體感較強;圖2，3，細胞塊切片示腺癌排列成腺管狀，菊團狀等腺樣結(jié)構(gòu)。圖4，示涂片中的鱗狀細胞癌散在分布，圓形或不規(guī)則形，核染色質(zhì)深;圖5，示細胞塊切片中的鱗狀細胞癌排列成片狀，見明顯細胞間橋;圖6，細胞塊切片顯示乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的環(huán)狀排列。HE×200。

3 討論

漿膜腔積液常是某些疾病的并發(fā)癥，有時甚至是唯一的臨床表現(xiàn)。引起漿膜腔積液的病變主要有良性病變(如:炎癥，外傷，結(jié)締組織病等)和惡性腫瘤(最常見的是轉(zhuǎn)移性腺癌)，對漿膜腔積液的病因判斷最具有意義的是確定到底是炎癥還是腫瘤，多數(shù)病例憑傳統(tǒng)涂片常規(guī)染色能判斷良惡性，但缺乏客觀指標，其次直接涂片法由于制片及細胞本身分布情況限制，對于腫瘤的分型卻不太理想，還可能因為標本少，含血，膠凍狀標本導(dǎo)致細胞少或細胞變形影響診斷而誤診，并且漿膜腔積液是一種良好的培養(yǎng)基，腫瘤細胞脫落到積液中可以形成與腫瘤原發(fā)灶不同的細胞形態(tài)，腫瘤細胞形態(tài)的多樣性及其形態(tài)學(xué)改變的不一致性往往令人真假難辨［1］;該組病例中傳統(tǒng)涂片法1例陰性，后經(jīng)細胞塊及臨床和組織學(xué)確定為惡性，考慮為涂片細胞較少漏診所致，因此，僅憑常規(guī)涂片鏡下結(jié)果選擇治療方案風險過高。

正常成熟的間皮細胞為圓形或卵圓形，胞漿淡染，核居中染色質(zhì)纖細，分布均勻，但在慢性炎癥、放療化療及腫瘤的刺激下間皮細胞增生旺盛，增生活躍的細胞表現(xiàn)較幼稚，或間皮細胞出現(xiàn)退化現(xiàn)象。細胞呈現(xiàn)一定的異形性，核略增大，可呈假腺腔樣或桑葚狀排列，間皮細胞變化多端，增生活躍的間皮細胞或反應(yīng)性異形增生的間皮細胞與癌細胞辨別是漿膜腔積液細胞學(xué)診斷難點之一，有時散在或小片狀分布的鱗狀細胞癌在積液中會形成圓形細胞，失去了鱗狀細胞癌的梭形，不規(guī)則形等多形性，加之積液中的細胞易出現(xiàn)空泡變性常誤認為退變的間皮細胞，這時間皮細胞與癌細胞較難鑒別。細胞塊石蠟切片可以彌補涂片這方面的不足，該方法可以收集到的有核細胞多，細胞結(jié)構(gòu)清晰，并能保持一定的組織學(xué)結(jié)構(gòu)和排列方式，有利于常規(guī)病理學(xué)診斷［2］。對于血性漿膜腔積液經(jīng)過溶解紅細胞處理，紅細胞消失了，而有核細胞保存完整不變形，染色質(zhì)清晰可辯，尚存成團，成堆腫瘤細胞的原有結(jié)構(gòu)，在切片中顯示細胞的微粒組織結(jié)構(gòu);與常規(guī)涂片法相結(jié)合，大大提高了細胞學(xué)的陽性檢出率［3］。惡性積液97%左右為轉(zhuǎn)移癌，而轉(zhuǎn)移癌中腺癌占95%［1］，所以首先把轉(zhuǎn)移性腺癌鑒別出來，具有很重要的意義，其余3%為原發(fā)于間皮的腫瘤(間皮瘤)，間皮瘤細胞在積液中散在分布，細胞分界清楚，有單核，雙核及瘤巨細胞，核常居中，與正常或變性的間皮細胞極易混淆，容易漏診;有時間皮瘤細胞亦可鑲嵌，成團排列，與轉(zhuǎn)移性腺癌類似，難以鑒別［4－5］，此時可以借助細胞塊免疫組化染色加以區(qū)分，有些漿膜腔積液瘤細胞較少或細胞有些異型，但不夠典型，涂片很難診斷，只能報告為疑癌細胞或異型細胞，正確區(qū)分或判別這些細胞的性質(zhì)和類型，可以給患者帶來最佳治療時機，也是給臨床醫(yī)師一個信息。本組26例不確定病例(11例疑癌和15例異型細胞)經(jīng)細胞塊也都得到了明確診斷，把增生的間皮細胞和反應(yīng)性增生的細胞與惡性癌細胞鑒別開來，增生的間皮細胞在細胞塊中是松散排列或流水樣平鋪排列，細胞邊緣不整齊，沒有癌細胞的緊密結(jié)構(gòu)，細胞染色質(zhì)細膩均勻。而真正的惡性細胞常可見到腺腔樣，乳頭狀，或緊密的片狀排列，細胞染色質(zhì)較粗，顆粒狀或團塊狀，異型明顯，常規(guī)細胞學(xué)涂片結(jié)合細胞塊切片能夠顯示細胞排列方式及組織結(jié)構(gòu)，使這部分細胞能夠明確分類，給患者治療提供一個正確的方向，1例細胞塊未確定診斷患者曾轉(zhuǎn)安徽省立醫(yī)院治療，患者2周內(nèi)死亡。結(jié)合臨床及免疫組化為臨床查找原發(fā)灶提供客觀依據(jù)。其次，細胞塊石蠟切片免疫組化染色是鑒別漿膜腔積液中異型細胞良惡性及惡性細胞組織來源的理想方法［6－7］。增生的間皮細胞在免疫組化中表達calretinin，mesothelial，vimtin，一般不表達CEA，EMA以及一些組織相對特異性標志物，如細胞表達TTF-1高度提示腫瘤來源于肺或甲狀腺，表達CEA，CK20，提示腫瘤來自消化道，表達CK7，CA125可能來源于子宮附件，其對于傳統(tǒng)涂片不僅提高了陽性檢出率，而且明確了組織來源［8－9］。另外，細胞塊對不能切除腫瘤的病人提供了可永久保存的保本，可應(yīng)用于分子病理診斷，為惡性腫瘤患者提供了一種行之有效的組織學(xué)分型和基因檢測途徑，為惡性腫瘤晚期和需靶向治療的患者提供了可靠的分子病理診斷依據(jù)［10］，以指導(dǎo)分子靶向藥物的篩選，為這類患者提供一種臨床治療手段。對于一些復(fù)發(fā)腫瘤引起的積液，可以通過細胞塊免疫組化標記來對比腫瘤的免疫表型有無改變，給臨床治療提供新思路。傳統(tǒng)涂片利于觀察細胞或細胞團的整體輪廓，細胞塊切片可顯示細胞群團的內(nèi)部結(jié)構(gòu)［11］細胞塊石蠟切片與傳統(tǒng)涂片相結(jié)合的方法，架起了細胞學(xué)與組織學(xué)之間溝通的橋梁，為細胞學(xué)的正確診斷提供有力保障。

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