正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選補(bǔ)肺益腎膠囊醇提工藝

韓 露，李成網(wǎng)，嚴(yán) 群

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥 230031;2.安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，安徽 合肥 230061)

補(bǔ)肺益腎膠囊為安徽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院的院內(nèi)制劑，由山茱萸、丹參、五味子等八位中藥組成，具有調(diào)補(bǔ)肺腎，納氣平喘之功效。臨床上主要用于治療慢性阻塞性肺疾病(COPD)，中醫(yī)辨證為肺腎兩虛癥的患者。本文采用正交試驗(yàn)法［1］，以丹參酮ⅡA、馬錢苷的總轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，對補(bǔ)肺益腎膠囊的醇提工藝進(jìn)行考察，篩選最佳的提取工藝。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀(美國Waters600)，百萬分之一電子天平(德國 METTLER TOLEDO XP56)，山茱萸、丹參等藥材購自合肥市中藥飲片廠義和堂藥店，丹參酮ⅡA對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110766－200416)、馬錢苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:111640－200502)，甲醇、乙腈均為色譜純，水為超純水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 醇提工藝流程 采用L9(3)4正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平表見表1。

按處方量稱取山茱萸、丹參及其它藥材，共稱9份，按正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分別加乙醇回流。

2.2 丹參酮ⅡA 含量測定［2－3］

2.2.1 色譜條件［4］色譜柱:Inertsil ODS－3柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇-水(75∶25)，流速 1 mL·min－1，檢測波長 270 nm，進(jìn)樣量 20 μL，柱溫 30℃。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取丹參酮ⅡA對照品適量，精密稱定，用甲醇制備成每1 mL含丹參酮ⅡA 53.1μg的丹參酮ⅡA對照品儲備液。

表1 因素水平表

2.2.3 供試品溶液的制備 取2.1項(xiàng)下已定容至1 000 mL的樣品液(共9份)，搖勻，濾過，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

2.2.4 丹參藥材供試品溶液的制備 取丹參粉末(過三號篩)約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，微孔濾膜濾過，提取，濾過，合并濾液，并定容至1 000 mL。即得。

2.2.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.2.2項(xiàng)下丹參酮ⅡA 對照品儲備液 1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL 至 10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。按上述色譜條件，分別進(jìn)樣20 μL，測定其峰面積值，并以對照品濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積值(Y)為縱坐標(biāo)，得回歸方程為Y=94864X－26766，r=0.999 9(n=6)，丹參酮ⅡA 在 5.31 ～ 53.1 mg·L－1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6 供試品溶液的測定 按上述色譜條件，精密吸取對照品溶液、1～9號供試品溶液及丹參藥材供試品溶液各20 μL，依次注入液相色譜儀中，測定峰面積值。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取對照品溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積值，RSD為0.46%，說明儀器精密度良好。

2.3 馬錢苷含量測定［5－6，8］

2.3.1 色譜條件［7］色譜柱:Inertsil ODS-3柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈-水(15∶85)，流速 1 mL·min－1，檢測波長 240 nm，進(jìn)樣量 20 μL，柱溫 30℃。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取馬錢苷對照品適量，精密稱定，用甲醇制備成每1 mL含馬錢苷94.7 μg的馬錢苷對照品儲備液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取2.1項(xiàng)下已定容至1000 mL的樣品液(共9份)，搖勻，濾過，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

2.3.4 山茱萸藥材供試品溶液的制備 取山茱萸粉末(過三號篩)約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，稱定重量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，微孔濾膜濾過，即得。

2.3.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取上述馬錢苷對照品儲備液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL 至10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。按上述色譜條件，分別進(jìn)樣20 μL，測定其峰值面積，并以對照品濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積值(Y)為縱坐標(biāo)，得回歸方程為 Y=30496X+19750，r=0.9999(n=6)，則馬錢苷在 9.47 ～ 94.7 μg·mL－1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.6 供試品溶液的測定 按上述色譜條件，精密吸取對照品溶液、1～9號供試品溶液及山茱萸藥材供試品溶液各20 μL，依次注入液相色譜儀中，測定峰面積值。

2.3.7 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取對照品溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測峰面積值，其RSD為0.37%，說明儀器精密度良好。

2.4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果［9－10］按 L9(3)4［11］正交表，以丹參酮ⅡA和馬錢苷的總轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)進(jìn)行分析。試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 L9(3)4正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

由直觀分析結(jié)果可知，各因素影響程度依次為D＞C＞A＞B，即提取次數(shù)＞提取時間＞乙醇濃度＞乙醇用量。方差分析表明因素D、C具有顯著性影響，其中D3＞D2＞D1，C2＞C3＞C1.，因素B、A無顯著性影響。從節(jié)約乙醇的角度考慮，確定最佳提取工藝為A1B1C2D3。即70%乙醇，6倍量，回流提取3次，每次2 h。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 按處方量取山茱萸，丹參及其他醇提藥材，按上述優(yōu)化工藝條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，并依法測定，計(jì)算結(jié)果丹參酮ⅡA平均轉(zhuǎn)移率為75.31%;馬錢苷平均轉(zhuǎn)移率為93.78%，則總轉(zhuǎn)移率為169.09%，RSD 為2.19%。表明工藝條件穩(wěn)定可行。

3 討論

補(bǔ)肺益腎膠囊由八味中藥材組成，根據(jù)所含主要活性成分理化性質(zhì)分成水提、醇提、生粉入藥等工藝。經(jīng)文獻(xiàn)查證，丹參中醌類、酮類，山茱萸中苷類、三萜類，五味子中木脂素有較好的脂溶性，其中山茱萸中馬錢苷極性較大，丹參中丹參酮ⅡA和五味子中五味子甲素的極性較小，為了使各個極性的有效成分都能得有較好的提取，因此擬采用醇提工藝，以丹參中丹參酮ⅡA、山茱萸中馬錢苷的總轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法，優(yōu)選出最佳的醇提工藝。

醇提中若單獨(dú)以丹參酮ⅡA的轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，各因素影響大小為:D＞B＞A＞C，較佳工藝條件為A2B3C2D2;若單獨(dú)以馬錢苷轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，各因素影響大小為:D＞C＞A＞B，較佳工藝條件為A1B2C2D3，在以丹參酮ⅡA及馬錢苷總轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)時，各因素影響大小為:D＞C＞A＞B，較佳工藝條件為A1B2C2D3。由此可見，D(提取次數(shù))為最有顯著性的因素，且總轉(zhuǎn)移率在一定程度上更傾向于馬錢苷的轉(zhuǎn)移率。由于丹參酮ⅡA不穩(wěn)定，見光容易分解，因此做正交試驗(yàn)時應(yīng)在一天的時間內(nèi)平行做9份，并注意避光保存，避免丹參酮ⅡA的不穩(wěn)定對測定結(jié)果的影響，從而對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷造成影響。

根據(jù)總轉(zhuǎn)移率的測定結(jié)果，乙醇濃度和用量沒有顯著性差異，從節(jié)約成本的角度，選擇濃度70%、6倍用量。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明此工藝條件穩(wěn)定，可行，適合工業(yè)化大量生產(chǎn)。

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