雷公藤內酯對老年大鼠術后認知功能障礙海馬TNF-α表達的影響

商雄躍，高鐵梅，褚慶霞

(江蘇省南京市浦口區中心醫院1.重癥醫學科;2.麻醉科;3.呼吸內科，江蘇南京 211800)

術后認知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction，POCD)是指手術麻醉后數天內發生的一種可逆的、具有波動性的急性精神紊亂綜合征［1］。臨床上術后認知功能障礙比較常見，特別是老年人發病率較高，但病因、病情復雜多樣，容易受到忽視。術后認知功能障礙可導致患者康復延遲、住院天數延長和醫療費用增加等，嚴重時甚至影響病人出院后的生活質量。

研究發現，炎癥反應在POCD的病理改變過程中是關鍵因素，非甾體抗炎藥物可以降低圍術期炎癥反應，改善大鼠的學習與記憶能力。抑制炎癥反應對神經組織細胞的損害可能成為POCD防止的重要手段［2－3］。

雷公藤內酯(tripterygium glycosides，TP)是衛矛科植物雷公藤的去皮根部提取的環氧化二萜內酯類化合物，具有較強的抗炎、免疫抑制作用，且能通過血腦屏障，已成功用于類風濕性關節炎、紅斑狼瘡等自身免疫性炎癥性疾病［4－6］。目前關于雷公藤內酯對于POCD的作用報道甚少。本實驗通過觀察雷公藤內酯對肝部分切除術后老年大鼠海馬TNF-α表達影響，為將來將TP用于POCD的防治提供可能的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑 健康SD大鼠56只，雌雄不限，20月齡，體重500～600 g，由徐州醫學院實驗動物中心提供，動物許可證號:2112379。Y型迷宮為張家港生物醫學儀器廠生產。雷公藤內酯由西安昊軒生物科技有限公司生產，純度＞98%。

1.2 實驗分組和動物模型的建立 用Y型迷宮初篩，去除對電擊耐受性差和對電擊不敏感的大鼠，按照隨機數字表法，將入選大鼠隨機分為3組:假手術組(sham組)(n=14)，模型組(POCD組)(n=21)和TP給藥實驗組(TP組)(n=21)。實驗組術前1 d、手術當日和術后1 d腹腔注射TP 0.4 mg·kg－1，共3次。假手術組和模型組腹腔注射等容積的4%丙二醇溶液。禁食12 h，自由飲水。假手術組行麻醉后打開腹腔不予肝臟部分切除;其余大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg·kg－1，翻正反射消失后仰臥位固定，碘氟消毒后在劍突下腹部正中線切開1.5～2.0 cm切口，進入腹腔分離左側葉肝臟，在遠端蒂部用1號絲線結扎后切除肝左葉。止血后逐層關腹。

1.3 認知功能測試 術后1、7 d時各取7只大鼠，采用Y型迷宮檢測術后第1、2、3、7、8、9天時的學習記憶能力。實驗時先將大鼠放入迷宮中適應3～5 min，然后以無規則次序變換安全區，以訓練大鼠辨別燈光刺激及安全方位的能力。每個實驗日對每只大鼠進行20次訓練，以大鼠在足底通電后10 s內一次性跑向安全區為正確反應，否則為錯誤反應。于每天19:00～22:00進行Y型迷宮實驗，采用固定次數隨機不休息法記錄大鼠全天總反應時間(一個實驗日大鼠完成20次反應所需時間，total reaction time，TRT)、每天出現錯誤反應的次數(error number，EN)和主動回避次數(active avoidence times，AAT)［7－8］。

1.4 免疫組織化學染色及圖像分析 術后第3天時各取7只大鼠，大鼠經升主動脈插管，4%多聚甲醛(4℃，pH 7.4)灌注固定，在大腦海馬區連續冠狀面冰凍切片，片厚25 μm，進行免疫組織化學染色。30%過氧化氫1份+純甲醇50份混合，室溫浸泡30 min。蒸餾水洗后滴加5%BSA封閉液，室溫20 min。甩去多余液體，滴加兔抗TNF-α抗體，4℃過夜。PBS洗滌2 min 3次。滴加生物素化山羊抗兔IgG，20～37℃ 20 min。PBS洗 2 min 3次。滴加試劑 SABC，20～37℃，20 min。PBS洗5 min 4次。DAB顯色，陽性細胞漿著色呈棕黃色。每只大鼠取3張切片，每張切片隨機取3個不同視野，采用纖維圖像分析系統(×100)測出TNF-α陽性細胞數和平均光密度。

2 結果

2.1 認知功能測試的結果 與假手術組比較，POCD組大鼠術后1 d全天總反應時間、錯誤反映次數、主動回避次數無明顯統計學差異(P＞0.05)，術后7 d全天總反應時間、錯誤反映次數、主動回避次數發生明顯改變(P＜0.05)。與模型組比較，實驗組大鼠術后8 d全天總反應時間明顯縮短(P＜0.05)，術后 2、3、7、8、9 d 錯誤反映次數明顯減少(P ＜0.05)，術后2、3、7、8 d 主動回避次數明顯增加(P ＜0.05)。見表1。

表1 肝部分切除術后各組大鼠學習記憶能力的比較(±s)

表1 肝部分切除術后各組大鼠學習記憶能力的比較(±s)

注:*與模型組比較，P ＜0.05:△與假手術組比較，P ＜0.05。

主動回避次數假手術組 —組別 術后 全天總反應時間/min錯誤反映次數6.2 ±1.7 9.6 ±2.2 1.4 ±0.4模型組1 d 5.4 ±1.6 1 0.8 ±2.5 0.9 ±0.7 2 d 4.7 ±0.4 7.1 ±2.3 3.5 ±0.9 3 d 4.7 ±0.4 5.4 ±2.1 4.5 ±1.2 7 d 4.9 ±0.5△ 6.7 ±2.1△ 3.8 ±0.7△8 d 4.7 ±0.8 6.3 ±1.8 3.7 ±1.1 9 d 4.5 ±0.3 2.7 ±0.8 6.7 ±1.3實驗組7.0 ±1.4 1 d 6.6 ±1.3 9.5 ±2.3 1.0 ±1.1 2 d 5.6 ±1.7 3.1 ±1.1* 6.7 ±1.1*3 d 5.2 ±1.2 2.2 ±0.7* 7.2 ±1.9*7 d 4.9 ±0.8 3.1 ±0.7* 6.4 ±0.9*8 d 3.7 ±0.7* 3.6 ±0.8* 6.5 ±1.5*9 d 2.9 ±0.6* 1.7 ±0.5*

2.2 免疫組織化學染色及圖像分析 與假手術組比較，模型組大鼠海馬區TNF-α陽性細胞數和平均光密度明顯增加(P＜0.05);與模型組比較，實驗組大鼠海馬區TNF-α陽性細胞數和平均光密度明顯降低(P＜0.05)。見表2。

3 討論

重大手術創傷導致患者免疫系統的激活，引起神經系統中炎性細胞因子(IL-1、IL-2、TNF)的釋放，造成中樞Ach、5-HT和NE等遞質系統的紊亂，導致中樞神經系統發生炎癥反應，通過炎癥因子介導從而造成與海馬功能變化相關的POCD［9］，神經元、小膠質細胞和外周可迅速釋放白細胞介素IL-6、IL-8和腫瘤壞死因子(TNF-α)等多種炎癥因子，可引起其他炎癥介質滲透到腦損傷部位，激活次級信號轉導通路，引起級聯放大效應，其中TNF-α可能發揮了相對重要作用。

表2 各組大鼠海馬TNF-a陽性細胞數和平均光密度值(n=5，±s)

表2 各組大鼠海馬TNF-a陽性細胞數和平均光密度值(n=5，±s)

注:與假手術組比較，*P ＜0.05:與模型組比較，△P ＜0.05。

組別 陽性細胞數 平均光密度值假手術組1 9.8 3 ±4.1 0.2 5 2 ±0.0 1 4模型組 64.7 5 ±1 1.34* 0.3 93 ±0.0 2 1*實驗組 5 1.6 3±7.47△ 0.3 5 1±0.0 1 6△

TNF-α是一種單核因子，主要由單核細胞和巨噬細胞產生，是一種多效性炎癥因子，對機體中幾乎所有器官都能產生效應。急慢性機體炎癥反應使促炎癥因子TNF-α的表達，并可通過炎癥免疫應答對大腦產生影響。最新的研究發現TNF-α具有調節炎癥反應與大腦功能，過多的TNF-α表達可致大鼠認知功能發生衰退。通過抗TNF-α治療并與對照組比較，認知功能有明顯的改善。本實驗中，模型組大鼠海馬區TNF-α陽性細胞數和平均光密度與假手術組比較明顯增加(P＜0.05)，提示TNF-α的高表達對認知功能障礙的形成起著重要作用。

本實驗中，模型組大鼠術后1 d全天總反應時間、錯誤反映次數、主動回避次數與假手術組比較無明顯統計學差異(P＞0.05)，可能與戊巴比妥鈉的麻醉殘留作用有關。術后7 d全天總反應時間、錯誤反映次數、主動回避次數與假手術組比較發生明顯改變(P＜0.05)，表明肝部分切除術后，模型組大鼠產生了認知功能障礙，本實驗建立模型是成功的。

中樞神經系統(central nervous system，CNS)雖然可以對創傷、應激和感染做出防御反應，但是可能存在延遲，不像外周組織那樣迅速產生粒細胞趨化和聚集。由于血腦屏障的保護作用，一般情況下僅T淋巴細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞進入腦組織，炎癥因子的表達水平和活性均較低。因此，以往觀點認為大腦是免疫特赦(immune privilege)器官。雷公藤內酯(tripterygium glycosides，TP)能通過血腦屏障，對炎癥早期毛細血管通透性增加引起的滲出和水腫有明顯抑制作用。本實驗中，實驗組大鼠術后8 d全天總反應時間明顯縮短(P ＜0.05)，術后2、3、7、8、9 d 錯誤反映次數明顯減少(P ＜0.05)，術后 2、3、7、8 d主動回避次數明顯增加(P ＜0.05)，表明雷公藤內酯明顯減輕肝部分切除術后大鼠認知功能障礙。

本實驗中，模型組大鼠海馬區TNF-α陽性細胞數和平均光密度與假手術組比較明顯增加(P＜0.05)，實驗組大鼠海馬區TNF-α陽性細胞數和平均光密度與模型組比較明顯降低(P＜0.05)，提示雷公藤內酯明顯減輕肝部分切除術后大鼠認知功能障礙可能與其通過抑制炎癥反應，減少TNF-α表達有關。

本實驗表明TNF-α與POCD的發生有相關性，并支持著POCD是炎癥性疾病的可能機制。但 TNF-α是否在POCD的發生中起決定性的獨立因素及其表達水平的減低是否能使POCD的發生率減小，還有待于進一步研究。

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