三種檢測方法測定甲氨蝶呤血藥濃度的比較分析

張媛媛，徐康康

(1.江蘇省腫瘤醫院藥劑科，江蘇 南京 210009;2.南京醫科大學南京兒童醫院醫學裝備部，江蘇南京 210008)

甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)為葉酸類抗腫瘤藥，臨床上廣泛用于治療急性淋巴細胞白血病、淋巴瘤、絨毛膜上皮癌和骨肉瘤等惡性腫瘤。大劑量甲氨蝶吟(High Dose Methoterxate，HD-MTX)結合甲酰四氫葉酸鈣(Calcium Folinate，CF)解救是目前急性淋巴細胞白血病、惡性淋巴瘤、骨肉瘤的重要治療方案之一［1-2］。HDMTX化療需要實施MTX血藥濃度監測，指導解救藥物CF的合理使用，避免MTX對患者造成的嚴重毒副作用［3-4］。

當前，國內外檢測生物樣品中MTX濃度的方法主要有免疫法和高效液相色譜法［5］。高效液相色譜法可將藥物與代謝產物以及內源性物質分離，具有專一性強的特點，是檢測MTX血漿濃度的金標準，但該法需復雜的前處理過程和較長的測定時間，不適合大樣本的快速檢測。盡管免疫法一定程度上會受到交叉反應的影響，但是其憑借快速、易操作的優點，已逐漸成為治療藥物監測的主要方法。而在MTX的生物藥品檢測中，均相酶放大免疫分析法(EMIT)方法更是逐漸成為快速檢測甲氨蝶呤血藥濃度的主要方法，將替代過去常用的熒光偏振免疫分析法(FPIA)方法。該方法保留了操作簡便、自動化程度高、測定周期短等特點，但其說明書中仍提示“該系統在測定MTX時存在正偏差，MTX的一種代謝產物 4-氨基-4-脫氧-N-10-甲基喋酸(APA)的交叉反應會使測定值被高估”。這三種方法各有其優缺點，各有所長。本文希望通過對相同一份樣品分別經3種方法分別檢測的結果，討論方法因素是否會對甲氨蝶呤血藥濃度的檢測產生影響，希望找出最有可能影響檢測結果的方法。

1 材料

1.1 樣本的收集 收集急性淋巴細胞白血病和惡性淋巴瘤患兒經HD-MTX化療后采集的血液樣本50份。將分離的血漿分成3份，于-45℃低溫保存，1周內分別用HPLC法、FPIA法和EMIT法測定。

1.2 HPLC法儀器和試劑 Hp1100高效液相色譜儀;色譜柱為Zorbax SB-C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相:0.05 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)/甲醇(體積比 78/22)，流速:1.0 mL·min-1，柱溫:40℃，檢測波長:306 nm。甲氨蝶呤對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號100138-200603)。

精密稱取甲氨蝶呤對照品適量，置于100 mL容量瓶中，用 0.05 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH6.8)溶解并稀釋至刻度。得約1 mmol·L-1的MTX對照品儲備液。置4℃冰箱保存，臨用前稀釋成所需濃度。

1.3 FPIA法儀器和試劑 雅培公司TDx-FLx藥物濃度分析儀，Methotrexate II定標(批號80226Q 100)，Methotrexate II質控(批號94049Q100)，Methotrexate II試劑(批號90359Q101)。

1.4 EMIT法儀器和試劑 西門子公司Viva-E全自動藥物濃度監測系統，Emit?Methotrexate定標(批號6L119UL-E1)，BIO-RAD Lyphochek?治療藥物監測質控(批號51793)，Emit? Methotrexate試劑(批號6L119UL-E1)。

2 方法

2.1 標準曲線 取空白血漿200 μL，準確加入MTX儲備液，配制成相當于血中MTX濃度分別為0.0495，0.099，0.198，0.495，0.694，0.991 μmol·L-1的樣品系列，經HPLC法繪制標準曲線。利用TDx-FLx和Viva-E血藥濃度測定儀配套定標溶液繪制標準曲線。

2.2 精密度 選擇高中低3個濃度的質控樣品各一份，每份樣品均由各自配套的儀器連續一日內連續測定6次和連續6日測定，分別計算日間和日內精密度。其中TDx-FLx和Viva-E血藥濃度測定儀分別選擇配套質控樣品，HPLC法選取“2.1”項下高中低三個濃度的溶液作為質控樣品。

2.3 穩定性試驗 選取“2.2”項下各質控樣品，在0 d，-45℃冷凍4、7 d后，分別在HPLC、TDx-FLx和Viva-E血藥濃度測定儀上測定，考察穩定性。

2.4 MTX血漿藥物濃度的測定 選用EDTA-K2抗凝靜脈血標本，離心分離血漿，先后在 HPLC、TDx-FLx和Viva-E血藥濃度測定儀上測定血漿中甲氨蝶呤濃度。每批次測定樣本時需對質控品進行平行測定。

2.5 數據分析 分別用HPLC、TDx-FLx和 Viva-E血藥濃度測定儀測定血漿中MTX濃度，樣本的正態性檢驗采用Kolmogorov-Smimov法。如符合正態分布，利用配對樣本t檢驗兩兩考察測定結果間是否存在差異，利用Deming回歸兩兩考察測定方法之間的相關性;如不符合正態分布，則用Friedman檢驗和Wilcoxon檢驗等非參數檢驗方法和Passing-Bablok回歸法進行分析。利用Bland-Altman偏差圖比較兩法測定結果均值的高低。

3 結果

3.1 標準曲線 HPLC法按“2.4”項方法處理后進樣分析，以MTX峰面積Y對濃度X(μmol·L-1)進行線性回歸，得回歸方程:Y=17 205.3X-4 005.96。r=0.999 7。FPIA 和 EMIT 法采用各自定標溶液，由系統自動獲取。

3.2 精密度測試結果 三種測定儀器均具有較好的批內和批間精密度，CV均＜7.50%(結果見表1)，其中在低濃度區間方法的精密度稍差。HPLC法三個水平質控品的質控品濃度分別為0.049 5，0.495，0.99 μmol·L-1;TDx-Flx 三個水平質控品的質控品濃度分別為 0.07，0.40，5.00 μmol·L-1;Viva-E系統三個水平質控品的質控品濃度分別為0.32，1.18，8.84 μmol·L-1。

表1 兩種儀器的日內、批間精密度的測定結果(n=6)

3.3 穩定性實驗結果 穩定性試驗結果顯示:樣品經凍融后，分別經三種檢測方法復測，檢測結果穩定(CV＜7%)。HPLC、FPIA和EMIT法檢測甲氨蝶呤的測定結果分別為(0.49 ±0.55)、(0.48 ±0.54)、(0.60 ±0.56)μmol·L-1。

3.4 數據分析 經Kolmogorov-Smirmov檢驗(P=0.011，P=0.017，P=0.014)，三組數據均符合正態分布。兩兩比較的差值配對 t檢驗結果(PHPLCvsFPIA=0.313，PHPLCvsEMIT＜0.01，PFPIAvsEMIT＜0.01)，提示HPLC法與FPIA法沒有顯著差別，而其它倆組都存在顯著差別。

利用Bland-Altman偏差圖比較兩法測定結果均值的高低(圖1)，結果顯示:FPIA法測定結果較HPLC 法低 0.01 mmol·L-1(95%CI:-0.09 ～0.10 mmol·L-1);HPLC法測定結果較EMIT法低0.11 mmol·L-1(95%CI:-0.23 ～ 0.01 mmol·L-1);FPIA法測定結果較 EMIT法低0.12 mmol·L-1(95%CI:-0.23 ～ -0.01 mmol·L-1)。

經Deming回歸法分析三種測定方法(圖2)，Spearman檢驗兩兩考察不同測定方法結果的相關性:YHPLC=1.00 XFPIA+0.015(r=0.978，P ＜0.000 1);YHPLC=0.94XEMIT-0.079(r=0.956，P ＜0.000 1);YFPIA=0.95XEMIT-0.089(r=0.927，P ＜0.000 1)。

圖1 三種測定方法測定結果的Bland-Altman圖

圖2 三種測定方法測定結果的Deming回歸曲線

4 討論

FPIA是根據熒光偏振原理建立的一種免疫分析方法，EMIT是一種酶放大免疫分析技術，二者均是利用免疫學原理進行特異性分析，測定結果會不同程度地受到的甲氨蝶呤兩種代謝產物——APA和7-OH甲氨蝶呤(7-OH MTX)的交叉反應而影響［6-8］。HPLC法作為色譜分析法的一種，可以將藥物原型及其代謝產物分離后，準確測定甲氨蝶呤的濃度，不受代謝物的影響。目前尚無研究同時考察三種測定方法，確定交叉反應引起的偏差大小。

許耘川［9］提示FPIA和HPLC法測定甲氨蝶呤血藥濃度的結果之間不存在顯著性差異。劉思婷［6］證實 EMIT方法比 FPIA法存在正偏差約0.2 mmol·L-1。吳先闖［10］的研究說明 EMIT 法比HPLC法存在約0.12 mmol·L-1的正偏差。但這種若干組兩兩比較的結果基于不同的待測樣品，且樣品數目也不同，無法通過偏差傳遞確定三種方法之間的大小關系。本文選用相同樣本分別用三種方法分別測定，同時利用多配對樣本的非參數檢驗方法，考察了三種檢測方法之間的差異，用Bland-Altman圖形直觀的反映該差異［11］，同時通過回歸分析法定量描述了不同檢測方法間的換算關系。

由于地區發展水平不一致，色譜法和免疫法都將在甲氨蝶呤的治療藥物監測工作中發揮作用，討論不同方法間的差異可以提高對于治療藥物監測數據的臨床價值。隨著新技術的發展，HPLC法和FPIA法由于各自的特點將在TDM工作中的應用將減少，但既往的檢測結果仍具有很高的研究價值。只有定量分析了方法間的差異，才有可能對接既往數據和未來新的研究數據，對接不同研究單位之間的研究成果。對于新興的EMIT法的研究證實存在顯著的正偏差，因此需要在化療中考慮到這個因素，回歸分析結果可以幫助臨床工作者將EMIT法測定結果換算成FPIA或HPLC估算值，減少代謝物對于臨床治療的誤導作用。

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