聚乙二醇化促胰島素分泌肽類似物的修飾條件優(yōu)化

賀曉強，范 開，，蔡曉娜，劉立平，陳 清

(1.重慶理工大學藥學與生物工程學院，重慶 400054;2.重慶富進生物醫(yī)藥有限公司，重慶 400041)

促胰島素分泌肽(glucogan-like peptide-1，GLP-1)是一種主要由腸道L細胞分泌，由30個氨基酸殘基組成的肽類激素。由于其相對分子質量小，在體內容易被二肽基肽酶-IV降解和被循環(huán)系統清除，且具有免疫原性和抗原性，因此在臨床應用上受到限制［1-3］。

聚乙二醇化(polyethylene glycol，PEG)修飾可起到延長藥物半衰期、降低藥物的免疫原性和抗原性、減少循環(huán)系統清除速率的作用。隨著PEG修飾技術的發(fā)展，定點修飾已經成為趨勢，而修飾劑馬來酰亞胺活化單甲氧基聚乙二醇(PEG Maleimide，mPEG-mal)就是最常用的修飾劑之一［4-6］。

艾塞那肽(商品名為Byetta)是含39個氨基酸的人工合成的多肽，它和天然的GLP-1有53%的同源性，都可以與GLP-1受體結合并激活，且不會被體內二肽基肽酶-IV降解，延長了半衰期［7-10］。Byetta(39肽)的氨基酸序列為HGEGTFTSDLSKQMEEE AVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS。 將Byetta最后一個氨基酸絲氨酸替換成一個半胱氨酸C(簡稱ByC39)，利用化學合成法合成，氨基酸序列為HGEGTFTSDLSKQMEEE AVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSC;然后用 mPEG-mal-40 kDa對ByC39進行定點修飾。根據文獻［11-12］，mPEG-mal-40 kDa在pH值為6.0～7.0的修飾緩沖體系中能特異地偶聯在蛋白或者多肽游離巰基上。因此，本文通過研究修飾pH值、修飾緩沖體系，以及修飾保護劑，對修飾條件進行優(yōu)化。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

原料:馬來酰亞胺活化單甲氧基聚乙二醇，相對分子質量為40 kDa(mPEG-mal-40kDa)，采購于北京鍵凱科技有限公司;ByC39多肽委托成都凱捷生物醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司化學合成，純度都在98%以上。

主要試劑:乙酸(CH3COOH)，乙酸鈉(CH3COONa)，三(2-羧乙基)膦(TCEP)，乙二胺四乙酸(EDTA)，賴氨酸(Lys)，均購于上海生工生物工程技術有限公司。

主要儀器:AKTA Basic100純化儀，美國 GE公司;島津LC-15C型高效液相色譜，日本島津;SP Sepharose F.F陽離子純化填料，Source 15RPC填料，美國 GE公司;Agilent 1120-LC-MS，德國 Agilent公司;實驗用水均采用Rios超純水系統處理。

1.2 試驗方法

1.2.1 修飾pH

ByC39多肽通過SP陽離子層析柱回收后，用pH 值為6.0、6.5、7.0 的 50 mmol/L CH3COONa-CH3COOH緩沖液稀釋3份終濃度為1.0 mg/mL的樣品，按照ByC39多肽與mPEG-mal-40kDa修飾劑反應摩爾比為1∶3的比例加入 mPEG-mal-40kDa修飾劑，25℃反應4 h，用RP-HPLC分析修飾率和SDS-PAGE檢測。

1.2.2 修飾緩沖體系

ByC39多肽通過SP陽離子層析柱回收后，用pH值為6.5的50 mmol/L CH3COONa-CH3COOH、50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖劑分別稀釋樣品至1.0 mg/mL，按照ByC39多肽與mPEG-mal-40kDa修飾劑反應摩爾比為1∶3的比例加入mPEG-mal-40kDa修飾劑，25℃反應 4 h，用 RPHPLC分析修飾產物。

1.2.3 修飾保護劑

ByC39多肽通過SP陽離子層析柱回收后，取同樣 2份，用 pH值為6.5的 50 mmol/L CH3COONa-CH3COOH緩沖稀釋樣品濃度至1.0 mg/mL。按照ByC39多肽與mPEG-mal-40kDa修飾劑反應摩爾比為1∶3的比例加入mPEG-mal-40kDa修飾劑，其中一個同時補入終濃度為2.0 mmol/L的Lys和5.0 mmol/L EDTA，另外一個不加任何試劑做對照。25℃反應4 h后，用TFA將pH值調為3.0，終止反應，取樣進行RP-HPLC分析。

2 實驗結果

2.1 SDS-PAGE和RP-HPLC檢測結果

1)SDS-PAGE檢測不同修飾pH值(6.0～7.0)對修飾率的影響，結果如圖1所示。

圖1 不同修飾pH值(6.0～7.0)凝膠電泳圖

2)RP-HPLC檢測不同修飾pH值(6.0～7.0)對修飾率的影響，如圖2～4所示。

圖2 pH=6.0時修飾結果

圖3 pH=6.5時修飾結果

在 pH值為6.0、6.5、7.0時修飾率分別為70%、95%、76%。前期研究發(fā)現PEG-ByC39在高pH值緩沖條件下蛋白性質不太穩(wěn)定，從提高修飾率、增加PEG-ByC39的穩(wěn)定性考慮，選擇pH值為6.5作為修飾條件，這樣既能達到高修飾率，又能保持蛋白的穩(wěn)定性質。

圖4 pH=7.0時修飾結果

2.2 RP-HPLC檢測2種緩沖體系對ByC39與mPEG-mal-40kDa修飾結合率的影響

經RP-HPLC分析(見圖5)，pH值為6.5的CH3COONa-CH3COOH緩沖體系和NaH2PO4-Na2HPO4緩沖體系對修飾效率影響非常小，說明蛋白在這2種緩沖中都很穩(wěn)定。但是PEG-ByC39的前期穩(wěn)定性研究表明其在醋酸鹽緩沖最為穩(wěn)定，因此選擇 pH值為6.5的 CH3COONa-CH3COOH緩沖液進行修飾。

圖5 不同緩沖體系中的修飾結果

2.3 RP-HPLC檢測修飾保護劑的不同對修飾率的影響

經RP-HPLC分析(見圖6)，2種修飾產物保留時間和修飾后的百分比基本一致，說明添加Lys和EDTA對目的產物的修飾率和修飾產物沒有太大影響。但是考慮到修飾過程中可能出現非特異性修飾或修飾不均一等情況，決定加入2.0 mmol/L Lys和5.0 mmol/L EDTA作為修飾保護劑。

3 優(yōu)化條件

通過上述實驗，在采用分子量為40 kDa的mPEG-mal修飾ByC39多肽時，得到優(yōu)化的修飾緩沖條件為:

①選擇在pH值為6.5的條件下進行修飾。

②選擇pH值為6.5的CH3COONa-CH3COOH緩沖液進行修飾。

③選擇在終濃度為2.0 mmol/L的Lys和5.0 mmol/L的EDTA的保護劑環(huán)境中進行修飾。

通過這些條件的優(yōu)化，可以提高修飾率以及增加修飾產物的穩(wěn)定性。

圖6 不同保護劑修飾后的結果

4 討論

聚乙二醇(PEG)是一類擁有良好水溶性的大分子聚合物，修飾后的多肽和蛋白質類藥物可增加藥物的穩(wěn)定性，延長藥物的半衰期，降低免疫原性等。近年來在聚乙二醇定點修飾領域的研究也取得了較大的進步，考慮到修飾條件在修飾過程中對修飾率、修飾產物、蛋白的穩(wěn)定性等方面都有較大的影響，因此修飾條件的優(yōu)化研究對開拓新藥研究也具有重要的意義。

艾塞那肽由禮來和Amylin兩家公司共同研發(fā)并于2005年6月由美國FDA批準上市。它通過促胰島素釋放和抑制胰高血糖素釋放、延緩胃排空、抑制食欲和改善β細胞功能等作用來調節(jié)血糖濃度，但是每日需要注射1次或2次，過短的半衰期限制了其在臨床上的運用。聚乙二醇定點修飾后可延長其在體內的半衰期且活性不會降低，可以克服其在臨床運用的缺陷，修飾后可達到長效的臨床效果，具有很好的研究前景。本研究通過對修飾條件的優(yōu)化，修飾率可達95%且修飾產物具有單一性，避免了在修飾過程中的一些非特異性的偶聯以及自身形成二聚體的風險，達到定點修飾產物單一性的目的，并且可提高修飾產物的穩(wěn)定性，延長半衰期，降低藥物免疫原性和抗原性，進而解決胰島素在體內的一些問題。但是對PEG化后的藥物在體內藥物代謝動力學性質還需進一步研究，以監(jiān)控藥物在體內的不良反應。本研究為新藥的開發(fā)和臨床應用研究提出新的方向。

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